해방풍 부위별 용매추출물의 항산화 활성 및 nitric oxide 생성 억제

해방풍은 경상북도 울진군 농업기술센터로부터 제공받 았다. 해방풍의 뿌리, 잎 및 씨앗은 각각 45℃에서 24시간 열풍 건조하였으며, 분쇄기(RT-04, Hanli Co., Sejong, Korea)로 분쇄하여 표준망체(60 mesh, Chung Gye Sang Cong Sa, Seoul, Korea)를 통과시킨 분말을 추출용 시료로 사용하였다.

추출물은 해방풍 부위별 분말 30 g에 고형분 대비 10배의 증류수, 70% 에탄올 및 70% 메탄올을 첨가하였다. 증류수 는 100℃에서 3시간, 70% 에탄올 및 70% 메탄올은 80℃에 서 3시간 동안 환류냉각추출기(CA-1112, Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 추출하였고 각각의 추출물은 불순물을 제거하기 위하여 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 여과 하였다. 여과된 용액은 감압농축기(Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 다음, 동결건조기(Free Zone 2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)로 건조하여 -70℃ 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.

해방풍 부위별 추출물의 수율은 동결건조(Free Zone 2.5, Labconco Co.)한 다음 건물 중량을 구하였고 시료 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(15)에 따라 시료 1 mL 에 1 N Folin Ciocalteu reagent 1 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 다음 20% Na₂CO₃ 1 mL를 첨가하여 실온의 암소에 서 30분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 작성 한 표준곡선으로부터 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 Jia 등(16)의 방법을 응용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 5% NaNO₂ 150 μL를 혼합하여 실온에서 6분간 반응 시킨 후 10% AlCl₃ 300 μL와 혼합하여 다시 실온에서 5분간 반응 시킨 후 1 N NaOH 1 mL와 혼합한 다음 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.) 를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보 노이드함량은 rutin(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

DPPH radical 소거활성은 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH)의 환원력을 이용하여 측정하였다(17). 즉, DPPH reagent는 DPPH 12 mg을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후 증류수 100 mL 첨가하여 흡광도를 517 nm에서 약 1.6으 로 조정하여 제조하였다. 시료 0.5 mL에 DPPH reagent 5 mL를 혼합하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 분광광도계 (Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)로 흡광도를 측정하고 아래와 같이 계산하였다.

$\text{DPPH radical\hspace{0.17em}소거 활성\hspace{0.17em}(\%)=1-}\frac{\text{S}}{\text{C}}\text{×100}$

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) radical 소거활성(18)은 7.4 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium persulfate를 최종 농도로 혼합하 여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS radical을 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되게 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 희석하였다. 희석 된 용액 180 μL에 시료 20 μL를 혼합하여 정확히 1분간 반응시킨 다음 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

$\text{ABTS radical\hspace{0.17em}소거 활성\hspace{0.17em}(\%)=1-}\frac{\text{S}}{\text{C}}\text{×100}$

Superoxide radical 소거활성은 Nishikimi 등(19)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 시료 500 μL에 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.5) 100 μL, 100 μM phenazine methosulfate(PMS, Sigma-Aldrich Co.) 200 μL를 혼합하여 반응 시킨 후 500 μL nitro blue tetrazolium(NBT, Sigma- Aldrich Co.) 200 μL 및 500 μM β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH, Sigma-Aldrich Co.) 400 μL를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 다음 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. Superoxide radical 소거활성은 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

$\text{Superoxide radical 소거 활성\hspace{0.17em}(\%)=1- }\frac{\text{S}}{\text{C}}\text{×100}$

FRAP는 Benzie와 Strain의 방법(20)에 따라 다음과 같이 측정하였다. FRAP reagent는 25 mL acetate buffer(300 mM, pH 3.6)를 37℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.) 2.5 mL와 20 mM ferric chloride(FeCl₃) 2.5 mL를 첨가하 여 제조하였다. 시료 30 μL에 제조된 FRAP reagent 900 μL와 증류수 90 μL를 넣은 후 37℃에서 10분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하 여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP는 FeSO4· 7H₂O(Sigma-Aldrich Co.)을 정량하여 작성한 표준곡선으 로부터 계산하였다.

실험에 사용한 대식세포주인 RAW 264.7(KCTC No. 40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum (Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1% penicillinstreptomycin( Gibco BRL Co.)을 첨가하여 배양하였다. 세포 는 모두 37℃, 5% CO₂ incubactor(MCO-18 AIC, Sanyo Co., Osaka, Japan)에서 배양하였다.

세포독성은 MTT assay로 측정하였으며, 배양된 세포주 를 5×10⁴ cell/well의 농도로 조정하여 96 well plate에 100 μL씩 첨가하여 24시간 배양하고 이후 새로운 배지에 시료 를 농도별로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 녹인 methyl thiazol-2-YL-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(5 mg/mL, Sigma-Aldrich Co.) 용액을 각 well에 10 μL씩 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 이후 상등액을 완전히 제거하 고 dimethyl sulfoxide(DMSO, Jensei Chemical Co., Tokyo, Jpan) 100 μL를 각 well에 첨가하여 10분간 반응시켜 formazan 결정을 완전히 용해한 다음 microplate reader (UVM-340, Asys Co., Biochrom, Cambridge, UK)를 이용하 여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

RAW 264.7 세포를 5×10⁴ cell/well이 되도록 96well plate 에 각각 100 μL씩 첨가하여 24시간 배양하고, 농도별 시료 및 lipopolysaccharide(LPS, 0.1 μg/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 상등액 50 μL에 동량의 Griess 시약(Sigma-Aldrich Co.)을 혼합하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader(UVM-340, Asys Co.) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, NO 생성 량은 sodium nitrite(Sigma-Aldrich Co.)의 농도별 표준곡선 을 이용하여 계산하였다.

모든 실험결과는 IBM SPSS Statistics(19.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용한 분산분석(ANOVA)을 실시하 였고 각 측정 평균값의 유의성 (p<0.05)은 Duncan's multiple range test를 실시하여 검정하였다.

해방풍 부위별 용매추출물의 추출수율, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 추출용매에 따른 추출수율은 뿌리 및 씨앗 열수추출물이 다른 용매에 비해 높게 나타났으며, 부위별 추출수율은 뿌리의 경우 열수추 출물이, 잎은 70% 메탄올 추출물에서 가장 높게 나타났다.

추출용매별 총 폴리페놀 함량은 70% 에탄올 추출물에서 3.54-10.79 g/100 g으로 가장 높았으며, 70% 메탄올 및 열수 추출물이 각각 3.33-10.18 g/100 g 및 1.86-8.11 g/100 g으로 나타났다. 해방풍 부위별 총 폴리페놀 함량은 잎 추출물에 서 10.79 g/100 g으로 나타났으며, 씨앗 및 뿌리 추출물이 각각 9.30 g/100 g 및 3.54 g/100 g으로 나타나 뿌리부위의 폴리페놀 함량이 낮음을 확인하였다. 식물체에 함유되어 있는 페놀 화합물들은 다양한 항산화 활성 및 생리활성 기능을 가지고 있는데 이것은 분자 내 phenolic hydroxyl기 가 효소 단백질과 같은 거대 분자들과 결합하는 성격이 있어 이러한 생리활성 기능을 나타내는 주체로 인정되고 있다고 알려져 있다(21). 특히 항산화 활성과 관련하여 최근 생체 내에서의 산소 free radical 반응이 생체조직의 노화나 질병과 관련이 있어 페놀성 물질의 hydroxyl group은 유지 의 유리기 수용체로서 유지 산패의 초기 단계에 생성된 유리기들이 안정된 화합물을 형성하도록 하여 산화억제 작용을 한다. 즉 페놀 함량이 높게 나타남은 산화 억제 작용 이 높음을 의미한다(22). 추출용매에 따른 총 플라보노이드 함량은 70% 에탄올 추출물에서 0.79-2.01 g/100 g으로 가장 높게 나타났으며, 70% 메탄올 및 열수추출물이 각각 0.35-1.56 g/100 g 및 0.33-1.43 g/100 g으로 나타났다. 해방 풍 부위별 총 플라보노이드 함량은 잎 추출물에서 2.01 g/100 g으로 가장 높았고, 씨앗 및 뿌리 추출물이 각각 1.43 g/100 g 및 0.79 g/100 g으로 나타나 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향이었다. 추출용매의 경우 70% 에탄올에서 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타났으 며, 해방풍 부위의 경우 잎 추출물이 가장 높음을 확인하였 다. 식물체에 함유되어 있는 폴리페놀은 만성질환에 강력 히 저항하는 기능성을 지닌 2차 대사산물이고 식물유래 식품에서 활성산소를 수용하는 역할을 하여 항산화 효과를 나타낸다고 보고하였으며(23), 폴리페놀과 플라보노이드 는 세포를 공격하는 유리라디칼(ROS, OH, NO)의 산화작용 을 억제 및 소거하는 기능기를 포함하고 있다(24). 또한 Wang 등(25)에 의하면 DPPH radical 소거능과 총 페놀 화합 물의 함량은 밀접한 상관관계가 있음이 보고된 바 있다. 이에 근거하여 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 높게 나타난 70% 에탄올 잎 추출물이 항산화 활성이 우수 할 것으로 사료되었다.

해방풍 부위별 용매추출물의 DPPH radical 및 ABTS radical 소거활성은 Fig. 1 및 2와 같다. DPPH radical 소거활 성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 추출 용매의 경우 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 4.09-84.70% 및 4.31-83.26%로 열수추출물에 비해 높은 항 산화 활성을 나타내었다. 해방풍 부위별 DPPH radical 소거 활성은 잎 추출물에서 84.70%로 가장 높았고, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 75.56% 및 25.05%으로 나타나 뿌리 추출물이 가장 낮았다. ABTS radical 소거활성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며, 70% 에탄올 및 70% 메 탄올 추출물에서 각각 9.58-57.64% 및 9.49-52.31%로 높은 활성을 나타내었다. 해방풍 부위별 용매추출물의 경우, DPPH radical 소거활성과 같이 잎 추출물에서 57.64%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 각각 34.64% 및 16.06%으로 나타났다. Kwon 등(26)의 연구 결과에서 산겨릅나무의 DPPH radical 소거활성이 에탄올 추출물, 열수 추출물 및 수용액 분획물이 각각 85.30%, 77.70% 및 79.80%로 에탄올 추출물에서 높게 나타났다고 보고하여 본 연구와 유사한 경향이었다. 또한 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 높게 나타난 잎 70% 에탄올 추출물이 DPPH 및 ABTS radical 소거활성에서도 높은 활 성을 나타내어 총 폴리페놀 함량이 증가하면 항산화 활성도 증가한다는 Seo 등(27)과 Lee 등(28)의 보고와 유사하였다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of extracts from Glehniae Radix. (A) HR, hot-water extracts of root from Glehniae Radix; HL, hot-water extracts of leaf from Glehniae Radix; HS, hot-water extracts of seed from Glehniae Radix. (B) ER, 70% ethanol extracts of root from Glehniae Radix; EL, 70% ethanol extracts of leaf from Glehniae Radix. (C) ES, 70% ethanol extracts of seed from Glehniae Radix; MR, 70% methanol extracts of root from Glehniae Radix; ML, 70% methanol extracts of leaf from Glehniae Radix; MS, 70% methanol extracts of seed from Glehniae Radix. Means±SD (n=3) with different letters (a-j) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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Fig. 2. ABTS radical scavenging activity of extracts from Glehniae Radix. (A) HR, hot-water extracts of root from Glehniae Radix; HL, hot-water extracts of leaf from Glehniae Radix; HS, hot-water extracts of seed from Glehniae Radix. (B) ER, 70% ethanol extracts of root from Glehniae Radix; EL, 70% ethanol extracts of leaf from Glehniae Radix. (C) ES, 70% ethanol extracts of seed from Glehniae Radix; MR, 70% methanol extracts of root from Glehniae Radix; ML, 70% methanol extracts of leaf from Glehniae Radix; MS, 70% methanol extracts of seed from Glehniae Radix. Means±SD (n=3) with different letters (a-j) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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해방풍 부위별 용매추출물의 superoxide radical 소거활성 및 FRAP 활성은 Fig. 3 및 4와 같다. Superoxide radical 소거활성은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 3.26-84.05% 및 2.06-72.38%로 높은 항산화 활성을 나타내 었다. 해방풍 부위별 superoxide radical 소거활성은 잎 추출 물에서 11.15-84.05%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 각각 32.76-73.41% 및 5.83- 40.82%으로 나타나 1,000 μg/mL 농도에서 잎 추출물은 뿌 리 추출물에 비해 대략 2배 높은 항산화 활성을 나타내었다.

Fig. 3. Superoxide radical scavenging activity of extracts from Glehniae Radix. (A) HR, hot-water extracts of root from Glehniae Radix; HL, hot-water extracts of leaf from Glehniae Radix; HS, hot-water extracts of seed from Glehniae Radix. (B) ER, 70% ethanol extracts of root from Glehniae Radix; EL, 70% ethanol extracts of leaf from Glehniae Radix. (C) ES, 70% ethanol extracts of seed from Glehniae Radix; MR, 70% methanol extracts of root from Glehniae Radix; ML, 70% methanol extracts of leaf from Glehniae Radix; MS, 70% methanol extracts of seed from Glehniae Radix. Means±SD (n=3) with different letters (a-k) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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Fig. 4. FRAP(ferric reducing antioxidant power) activity of extracts from Glehniae Radix. (A) HR, hot-water extracts of root from Glehniae Radix; HL, hot-water extracts of leaf from Glehniae Radix; HS, hot-water extracts of seed from Glehniae Radix. (B) ER, 70% ethanol extracts of root from Glehniae Radix; EL, 70% ethanol extracts of leaf from Glehniae Radix. (C) ES, 70% ethanol extracts of seed from Glehniae Radix; MR, 70% methanol extracts of root from Glehniae Radix; ML, 70% methanol extracts of leaf from Glehniae Radix; MS, 70% methanol extracts of seed from Glehniae Radix. Means±SD (n=3) with different letters (a-k) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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FRAP 활성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며. 추출용매별 FRAP 활성은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 각각 142.38-975.25 μM 및 148.20-942.47 μM로 높은 활성을 나타내었다. 해방풍 부위 별 용매추출물의 FRAP 활성은 잎 추출물에서 975.25 μM로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 씨앗 및 뿌리 추출물에서 각각 815.72 μM 및 212.51 μM으로 나타나 1,000 μg/mL 농도에서 잎 추출물은 뿌리 추출물에 비해 약 4배 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이는 superoxide radical 소거활 성과 유사한 경향을 나타내었으며, Kim 등(29)의 연구에서 어성초 열수 추출물의 경우 375.9 μM Trolox/g extract, 70% 에탄올 추출물의 경우 860.5 μM Trolox/g extract로 나타나 70% 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비해 2.29배 유의적으 로 효과가 있다고 보고하여 본 연구와 유사하였다. 식물에 포함되어 있는 다양한 페놀산 및 플라보노이드는 산화·환 원에 영향을 미친다고 보고하였으며(30), 본 연구를 통해 국내 자생 해방풍 부위별 추출물이 철 이온 환원력에 탁월 한 효과가 있음을 증명하였으며 해방풍 잎 추출물은 다양한 라디칼에 대한 소거활성이 다른 부위에 비해 우수하여 생체 내 산화적 스트레스에 대한 항산화 물질로써 활용 가능함을 확인하였다.

해방풍 부위별 열수추출물(10-1,000 μg/mL)과 해방풍 부 위별 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물(1-50 μg/mL)을 처리하였을 때 모든 시료에서 95% 이상 세포 생존율이 나타나 세포독성이 없음을 확인하여 nitric oxide 생성 억제 세포실험의 농도로 설정하였다.

대식세포에서 염증 매개인자인 nitric oxide(NO)는 박테 리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지 만, 병리적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 산화적 스트 레스로 작용하여 세포 손상을 일으키고, 염증 및 암을 유발 한다(31-34). 이러한 산화적 스트레스를 제거하기 위해 항 산화 및 항염 효과가 증요하다. 따라서, 추출용매에 따른 해방풍부위별의항염활성을확인하기위해lipopolysaccharide (LPS, 0.1 μg/mL)로 자극을 유도한 Raw 264.7 세포를 이용 하여 NO의 생성에 미치는 영향을 분석하였다(Fig. 5). 모든 시료에서 농도 의존적으로 LPS에 유도되어 생성된 NO량 이 감소하는 것을 확인하였다. 추출용매에 따른 NO량은 50 μg/mL 농도에서 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물이 각각 5.25 μM 및 5.93 μM로 가장 낮은 nitric oxide 생성량을 보였으며, 해방풍 부위별에 따른 nitric oxide 생성량은 50 μg/mL에서 뿌리 및 잎 추출물이 각각 5.25 μM 및 9.80 μM로 가장 낮은 nitric oxide 생성량을 나타내었다. 앞서 실험한 항산화 활성과 비교하였을 때, 추출용매에 따른 활성은 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 우수한 항산화 활성 과 낮은 nitric oxide 생성량을 나태었으며, 해방풍 부위별에 따른 활성은 항산화 활성에서는 잎, 씨앗 및 뿌리 순으로 우수한 활성이 나타났으나, nitric oxide 생성량은 뿌리, 잎 및 씨앗 순으로 낮은 nitric oxide 생성량을 나타내었다. Kim(35)의 연구에서 LPS로 RAW 264.7 세포를 자극시킨 후 방풍정제물이 10여 가지의 inflammatory mediator의 억 제를 통해 염증반응을 제어한다고 보고하여 본 연구와 유사 한 경향을 나타내었으며, 이에 따라 해방풍은 염증반응을 일으키는 NO 생성을 억제하는 것을 확인하였다.

Fig. 5. Effect of polysaccharide extracts from Glehniae Radix on the nitr ic oxide production by Raw 264.7 cell. (A) HR, hot-water extracts of root from Glehniae Radix; HL, hot-water extracts of leaf from Glehniae Radix; HS, hot-water extracts of seed from Glehniae Radix. (B) ER, 70% ethanol extracts of root from Glehniae Radix; EL, 70% ethanol extracts of leaf from Glehniae Radix. (C) ES, 70% ethanol extracts of seed from Glehniae Radix; MR, 70% methanol extracts of root from Glehniae Radix; ML, 70% methanol extracts of leaf from Glehniae Radix; MS, 70% methanol extracts of seed from Glehniae Radix. Means±SD (n=3) with different letters (a-k) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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