효소처리에 의한 블루베리 음료 생산을 위한 최적추출조건

본 실험에 사용된 블루베리는 경상북도 고령군 소재 농 장에서 2014년 수확한 것을 구입하여 사용하였다. 구입한 블루베리를 -18℃에 냉동 보관하면서 분석 시료로 사용하 였고, 실험 직전에 동결된 블루베리를 각 처리구별 1 kg씩 실온에서 해동시킨 후 블렌더(blender)로 파쇄 후 실험에 사용하였다. 효소는 cellulase(27,000 U/g, Rohament®CL, AB Enzymes, Rajamäki, Finaland)와 pectinase(24,000 U/g, Rohapect®10L, AB Enzymes)를 구입하여 사용하였다.

효소의 종류 및 첨가량별 블루베리의 최적 추출조건을 확립하기 위하여 파쇄 된 블루베리 100 g에 증류수 900 mL로 혼합한 후 효소를 처리를 하였다. 효소는 cellulase 처리구(0.05%=67.5 U, 0.10%=270 U, 0.15%=607.5 U 0.20% =1,080 U), pectinase 처리구(0.05%=60 U, 0.10%=240 U, 0.15%=540 U, 0.20%=960 U), cellulase:pectinase를 1:1(w/v) 비율로 혼합하여 첨가한 처리구(0.05%=63.75 U, 0.10%=255 U, 0.15%=573.75 U, 0.20%=1,020 U)를 사용하였다. 각각의 효소 처리구는 45℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출수율 은 0.1% pectinase구와 cellulase:pectinase가 유사하였지만, 다양한 성분의 세포벽 분해를 위하여 cellulase:pectinase 혼 합 첨가 처리구를 선택하였다. 추출온도, 추출시간, 추출 교반속도별 최적조건 확립 실험에서는 cellulase:pectinase 혼합 효소 0.1%를 첨가하여 실험을 진행하였다.

최적 추출온도 확립을 위하여 온도를 40, 45, 50 및 55℃ 로 달리하여 3시간 추출하여 추출수율을 비교하였다. 최적 추출시간 확립을 위하여 가장 효율이 좋은 온도 45℃로 고정하고 시간을 0, 2, 3, 4 및 5시간으로 달리하여 추출하였 으며, 최적 추출 교반속도를 확립하기 위하여 온도는 45℃, 추출시간은 3시간으로 고정시킨 후 추출 교반속도를 0, 30, 60, 90 및 120 rpm으로 달리하여 추출액 중 추출수율, 당도, 산도, 총 페놀 및 유리당 함량을 측정하여 비교하였다.

각 처리구별로 추출한 블루베리 시료를 일정한 압력을 가하여 종이 여과지(125 mm, Whatman, Buckinghamshire, UK)로 여과한 후 무게를 측정하였으며, 총 블루베리 첨가 량에서 잔사 된 블루베리 양을 뺀 값을 총 블루베리 첨가량 으로 나눈 후 100을 곱하여 추출률을 구하였다.

pH 측정은 pH meter(pH/Ion 510, Oakton Instruments, IL, USA)를 이용하여 측정하였으며, 당도는 굴절당도계 (Master Refractometer, Atago, Tokyo, Japan)를 사용하여 측 정하였다.

총 페놀 함량은 Folin-Denis의 방법(19)을 변형하여 측정 하였다. 각 블루베리 추출 시료 용액 1 mL에 Folin & Ciocalteau's phenol reagent 1 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 10% Na₂CO₃ 용액 1 mL를 가한 다음 이 혼합 용액을 1시간 동안 정치한 후 UV/VIS 분광분 석기(UV-1280, Shimadzu Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하 여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 갈 릭산(gallic acid)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 페놀화합물 함량을 구하였다.

유리당 함량은 Jeong 등(20)의 방법을 응용하여 분석하였 다. 파쇄 한 블루베리 10 g에 80% 에탄올 200 mL를 가하여 수욕 상에서 3시간 환류 냉각 추출한 다음 여과하였다. 이 추출조작을 3회 반복하여 모은 여액을 감압·농축하여 용매 성분을 제거한 후 증류수 20 mL에 녹여 시료 용액으로 사용하였다. 블루베리 추출액의 유리당 함량 분석은 종이 여과지로 여과하여 찌꺼기를 제거한 후 시료액으로 사용하 였다. 증류수와 100% 메탄올(LiChrosolv, Merch-Millipore, Darmstadt, Germany)로 활성 시킨 Sep-Pak 카트리지(C₁₈ cartridge, Waters Co., Milford, MA, USA)에 시료액 5 mL를 통과시켜 불순물을 제거하였다. 처음 흘러나온 유출액 3 mL는 버리고, 나머지 2 mL를 취하여 멤브레인 필터(0.45 μm, Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany)로 여과 한 후 HPLC(Waters 2695 separation module, Waters Co.)를 이용하여 분석하였다. 사용된 칼럼(column)은 Unison UK-Amino(150×4.6 mm, IMTAKT Co., Tokyo, Japan), 용매 는 80% 아세토니트릴(Acetonitrile, LiChrosolv, Merch- Millipore), 유속은 1.0 mL/min, 검출기는 reactive index detector(RID)를 사용하여 분석하였다.

실험결과는 SAS 9.1 version을 이용하여 각 시료의 평균 과 표준편차를 계산하였고, 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test을 실시하여 시료 간의 유의차를 검정하 였다(p=0.05).

Cellulase, pectinase, cellulase:pectinase(1:1) 혼합 효소를 0.05, 0.1, 0.15 및 0.2% 첨가하여 얻은 블루베리 추출액 중 추출수율, 당도 및 pH를 측정한 결과는 Table 1과 같다. 추출수율은 pectinase 효소를 0.05, 0.1, 0.15, 0.2% 처리하였 을 때, 각각 87.06, 87.93, 87.49, 87.81%의 결과를 보였으며, cellulase 효소를 0.05, 0.1, 0.15, 0.2% 처리하였을 때, 각각 85.94, 86.18, 85.72, 86.55%로 나타났다. Cellulase:pectinase (1:1) 혼합하여 0.05, 0.1, 0.15, 0.2% 처리구에서 각각 86.84, 87.77, 87. 25, 88.14%로 나타나, cellulase 및 pectinase 단독 효소로 처리한 구보다 추출수율이 우수하였다. Pectinase와 cellulase 단독으로 처리하여 얻은 블루베리 추출액의 수율 은 각각 87.06-87.93%와 85.72-86.55%로 효소를 처리하지 않은 대조구 85.02% 보다 높은 값의 범위를 나타내었다. 효소 처리구에서 대조구 보다 추출수율이 우수하게 나타난 결과는 cellulase와 pectinase 효소는 추출 시 식물 세포벽 및 펙틴을 분해하는 데 중요한 인자로 알려져 있으므로, 블루베리에 이들 효소를 첨가하여 추출하는 동안 cellulase 는 세포벽을 분해하여 수율을 향상시키고, pectinase는 과즙 내 펙틴을 분해하여 수율을 증가시킨 결과로 사료된다. 시 료들의 당도는 1.10-1.23 °Brix의 범위로 유의적인 차이는 없었으나 cellulase:pectinase 혼합 효소의 첨가량이 많아질 수록 점점 상승하는 경향을 보였다. pH는 모든 처리구에서 3.19-3.28의 범위로 효소처리에 의한 영향이 거의 없었다. 블루베리 추출액의 pH는 각종 유기산 및 다양한 성분 물질 들에 의하여 3.5-4.5라고 보고되었다(21). Yoon 등(22)의 블루베리 착즙액의 pH는 3.08로 보고되어, 본 연구 결과와 유사한 값을 보였으나, Song 등(23)의 연구에서는 블루베리 착즙액 pH가 4.35로 보고되었다. 블루베리 추출액의 pH의 차이는 블루베리의 품종과 추출방법 등의 차이 때문으로 사료된다. 최적 추출효소 처리구 선정을 위하여 가장 중요 한 인자는 추출수율이므로, cellulase:pectinase(1:1) 처리구 결과 중 효소를 0.1% 처리구가 87.77%, 0.2% 첨가한 구의 88.14% 수율로 나타났으나, 결과 값은 유의적인 차이가 없었다. 경제적인 면을 고려하여 효소량 0.1% 처리구를 선택하였다.

블루베리 추출 최적 추출온도를 확립하기 위하여 cellulase:pectinase(1:1) 0.1% 처리하고 40, 45, 50, 55℃ 온도 에서 블루베리 추출액의 추출수율, 당도 및 pH를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 40, 45, 50, 55℃ 온도 범위에서의 추출수율은 각각 87.62, 87.91, 87.58, 87.65%로 조사되었으 며, 이 결과 중 45℃에서 87.91%로 가장 높은 추출수율을 보였다. 당도는 50℃에서 가장 높은 1.30 °Brix 값을 보였으 나 처리 간 유의적인 차이는 없었다. pH는 3.17-3.23의 범위 로 온도에 의한 영향이 거의 없었다. 블루베리 추출 최적 온도는 추출수율이 가장 우수한 결과를 나타낸 45℃로 선정 하였다.

블루베리 추출 최적 추출시간을 확립하기 위하여 블루베 리에 cellulase:pectinase(1:1) 혼합 효소를 0.1% 첨가하고 45℃ 온도에서 0, 2, 3, 4, 5시간 추출한 추출액의 추출수율, 당도 및 pH를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 0, 2, 3, 4, 5시간에서 블루베리 추출수율은 각각 85.21, 86.82, 87.88, 87.39, 86.68%로 조사되었으며, 3시간 및 4시간 추출 시 가장 우수한 결과를 보였다. 이 결과는 시간이 지날수록 추출성분의 농도가 증가하지만 유의적인 차이가 없으므로 3시간 이상 추출할 필요가 없을 것으로 판단되었다. 당도는 1.10-1.27 °Brix 값을 보였으며, 통계적으로 유의차가 없었 다. pH는 3.20-3.23의 범위로 시간에 의한 영향이 거의 없었 다. 최적 추출시간은 추출수율이 가장 우수한 3시간 추출하 는 것이 가장 적당할 것으로 사료되었다.

블루베리 추출 최적 교반속도 조건을 확립하기 위하여 블루베리에 cellulase:pectinase(1:1) 혼합 효소를 0.1% 첨가 하고 45℃, 3시간 동안 추출하면서 교반 속도를 0, 30, 60, 90, 120 rpm으로 달리하여 추출액의 추출수율, 당도 및 pH 를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 0, 30, 60, 90, 120 rpm에서 추출수율은 각각 87.51, 87.92. 88.48, 89.19, 88.92%의 결과 였으며, 90 rpm에서 89.19%로 가장 높은 값을 보였다. 0에 서 90 rpm의 교반속도까지는 속도가 증가할수록 추출수율 이 증가하였으나, 120 rpm까지 속도를 증가시켜도 추출수 율에 효과가 없는 결과를 보였다. 최적 교반속도는 추출수 율이 가장 우수한 90 rpm으로 선정하였다. 당도는 1.07- 1.20 °Brix 값을 보였으며, pH는 3.19-3.25의 범위로 교반속 도에 의한 영향이 거의 없었다.

페놀성 화합물 안토시아닌(anthocyanin), 카테킨(catechin), 클로로제닉산(chlorogenic acid) 등은 식물계에 널리 분포되 어 있는 2차 대사산물 중 하나로 다양한 구조와 분자량을 가진다. 페놀성 화합물의 페놀 수산기(-OH)는 단백질 등과 결합하는 성질을 가지며 항산화 효소와 함께 연속적인 짝반 응을 통해 간접적으로 자유전자를 소거하거나, 자유전자와 함께 공명안정화된 페녹시 전자(resonance-stabilized phenoxy radical)를 형성하여 직접 자유기를 제거한다. 이는 항산화, 항암 및 항균효과 등의 생리활성을 가지는 것으로 알려졌다 (24,25). 추출조건을 달리한 블루베리의 총 페놀 함량은 Fig. 1과 2에 나타냈다. 총 페놀함량 분석결과 효소를 첨가하지 않은 군에서는 16.8 mg/g를 나타내었고, cellulase 효소를 첨가한 군에서는 15.41-18.1 mg/g, pectinase 효소를 첨가한 군에서는 17.51-18.62 mg/g, cellulase:pectinase 혼합 처리군 에서는 15.23-17.81 mg/g로 유의적인 차이는 없었다. cellulase:pectinase(1:1) 혼합 효소 0.1% 사용하며 온도를 40-55℃로 처리한 구에서는 17.23-18.90 mg/g의 결과를 보 였으나, 유의적인 차이가 없었다. 추출시간에 따른 총 폴리 페놀 함량은 3시간 추출 시 18.06 mg/g으로 가장 우수한 결과를 보여서 추출 수율과 유사한 결과를 보였다. 교반속 도에 따른 함량은 16.51-19.14 mg/g의 범위를 나타내었다. 120 rpm 속도에서 19.14 mg/g의 함량으로 가장 높은 결과를 보였으나, 0-90 rpm 속도에서는 유의적인 차이가 없었다. Jeong 등(1)은 블루베리 추출액에서 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 9.02 mg/g의 총 페놀화합물 함량을 보였다고 보고하였다. 본 연구와 차이가 나는 것은 실험에 사용한 블루베리의 원산지, 품종뿐 아니라 실험 시 원료의 혼합 여부 등에서 비롯된 것으로 추측된다.

Fig. 1. Total polyphenol content of blueber ry extract according to different enzyme treatments and its ratio. Cellulase, pectinase, or cellulase:pectinase (1:1) mix were treated for 3 h at 45℃. Cellulase, Enzyme ratio (%) represents 60 U for 0.05%, 240 U for 0.10%, 540 U for 0.15%, 960 U for 0.20% in cellulase. Pectinase, while 67.5 U for 0.05%, 270 U for 0.10%, 607.5 U for 0.15%, 1,080 U for 0.20% in pectinase. Cellulas+Pectinase, 63.75 U for 0.05%, 255 U for 0.10%, 573.75 U for 0.15%, 1,020 U for 0.20% in cellulase:pectinase (1:1). Different letters indicate significant differences (p<0.05).

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Fig. 2. Total polyphenol contents of blueber ry extract based on temperature (A), time (B), and agitation rate (C) after fixing the enzyme and its amount. Enzyme incubation temperature was 40, 45, 50, or 55℃. Extraction time was 0, 2, 3, 4 or 5 h. Shaking speed was 0, 30, 60, 90, 120 rpm. 0.1% mix enzymes were treated for 3 h at 45℃. Values represent the mean±SD (n=3). Different letters indicate significant differences (p<0.05).

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본 시험에 사용된 블루베리 원료의 유리당 함량은 과당 2.53%와 포도당 2.40%이었다. Song 등(23)은 블루베리 유 리당 함량을 분석한 결과 과당 2.99%, 포도당 2.81%를 함유 하고 있는 것으로 보고하였는데, 이는 본 연구의 실험결과 와 유사한 결과를 나타내었다. Park 등(26)에 따르면 블루베 리에 포도당, 과당, 자당과 맥아당이 검출되었다고 보고하 여 본 연구 결과와 다소 차이가 보였으나, Lee 등(27)은 블루베리에서 과당과 포도당이 검출되었다고 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 보였다. 블루베리에 효소 처리, 온도, 시간, 교반속도 조건을 달리하여 제조한 블루베리 추출액 중의 유리당 함량을 분석한 결과를 Fig. 3과 4에 나타내었 다. 유리당 함량을 측정한 결과 모든 시료에서 과당과 포도 당이 검출되었다. 효소 무첨가 추출구인 대조구에서는 과 당 0.57%, 포도당 0.5%, cellulase 처리구에서는 과당 0.46-0.49%, 포도당 0.48-0.51%, pectinase 처리구는 과당 0.45-0.47%, 포도당 0.46-0.49%, cellulase:pectinase (1:1) 혼 합 효소 처리구는 과당 0.44-0.48%, 포도당 0.46-0.5%로 조사되었으나, 이들 결과 수치들은 유의적인 차이는 없어 서 효소의 종류 및 함량에 따라서 유리당 함량에 영향을 미치지 않은 것으로 판단된다.

Fig. 3. Free sugar glucose (A) and fructose (B) contents of blueber ry extract according to different enzyme treatments. Cellulase, Enzyme ratio (%) represents 60 U for 0.05%, 240 U for 0.10%, 540 U for 0.15%, 960 U for 0.20% in cellulase. Pectinase, while 67.5 U for 0.05%, 270 U for 0.10%, 607.5 U for 0.15%, 1,080 U for 0.20% in pectinase. Cellulase+Pectinase, 63.75 U for 0.05%, 255 U for 0.10%, 573.75 U for 0.15%, 1,020 U for 0.20% in cellulase:pectinase(1:1). Different letters indicate significant differences (p<0.05).

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Fig. 4. Glucose and fructose contents of blueber ry crude extract according to temperature (A), time (B), and agitation rate (C) after fixing the enzyme and its amount. Enzyme incubation temperature was 40, 45, 50, or 55℃. Extraction time was 0, 2, 3, 4 or 5 h. Shaking speed was 0, 30, 60, 90, 120 rpm. 0.1% mix enzymes were treated for 3 h at 45℃. Values represent the mean±SD (n=3). Different letters indicate significant differences (p<0.05).

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추출 온도를 달리한 유리당 함량 중 과당은 40℃, 포도당 은 45℃에서 높은 함량을 보였다. 유리당 함량은 효소의 최적 추출수율이 가장 우수한 온도인 45℃에서 비교적 높은 결과를 보였다. 추출시간에 따른 함량의 차이는 과당은 0시 간 보다 2-5시간 추출 시 높은 함량이었으며, 포도당은 5시 간 추출 시 가장 높은 결과를 보였다. 교반 속도에 따른 과당 및 포도당의 함량 모두 90 및 120 rpm에서 가장 높은 함량으로 조사되었다. 유리당 함량은 90 rpm에서 추출수율 이 가장 우수하였던 결과와 유사한 경향을 나타냈다.

본 연구에서는 블루베리를 저온에서 최적 추출 조건을 확립하고자 효소 종류 및 첨가량, 최적 온도, 최적 추출 시간, 최적 교반 속도를 비교하였다. 블루베리 음료 제조를 위한 최적 효소 선정 시 추출수율이 가장 우수하고 세포벽 의 다양한 성분을 분해할 수 있는 cellulase와 pectinase를 1:1(v/v) 혼합구를 선정하였으며, 경제적인 면을 고려하여 최소 첨가로 추출수율이 우수한 0.1% 첨가량으로 선정하였 다. 최적 추출 온도는 45℃, 추출 시간은 3시간, 교반 속도는 90 rpm에서 가장 우수한 결과를 보였다. 이상의 결과를 고려하여 블루베리 추출 최적 조건은 cellulase와 pectinase 를 1:1(v/v) 혼합효소 0.1%를 사용하여 45℃에서 3시간 동안 90 rpm 속도로 조사되었다. 본 연구결과를 바탕으로 블루베 리에 효소처리를 하여 추출수율을 증가시키고 국내산 생 과형 블루베리 음료 생산을 위한 자료로 활용할 수 있을 것이다.