아선약 추출물의 matrix metalloproteinase-1(MMP-1) 억제 및 제1형 프로콜라겐 합성 촉진 활성

본 실험에 시료로 사용한 아선약(Uncaria gambir)은 2011 년도 9월에 중국 후난성에서 채취 후 제조된 아선약을 사용 하였으며, 표본시료는 대구대학교의 식품공학과 천연물화 학실험실에 보관하고 있다. 본 실험에서 사용된 시약으로 procollagen typeⅠC-peptide EIA kit(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 을 구입하여 사용하였고 MMP-1 활성을 측정하기 위하여 MMP-1 kit(Amersham Bioscience, Piseataway, USA), 구입하여 사용하였고, human fibroblast세포로 HS68 은 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하여 사용하였다. 그 외에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상 의 등급을 사용하였다.

건조된 아선약 560 g을 잘게 마쇄하여 80% 메탄올(1L)로 실온에서 침지추출을 3회 반복하여 여과한 후 농축하였다. 얻어진 아선약 메탄올 추출물(430.5 g)에 대해 H₂O 0.2L로 현탁하여 Diaion HP-20(2.8 cm i.d.×58 cm, Mitsubishi Chemical Co., Tokyo, Japan) 수지를 활용한 칼럼크로마토 그래피를 실시하여, H₂O(211.0 g), 20% MeOH(93.7 g), 40% MeOH(62.1 g), 60% MeOH(30.5 g), MeOH(17.7 g) 및 70% acetone 용리액(0.2 g)을 얻었으며(Fig. 1), 각 분획물을 대상 으로 MMP-1 억제 및 type-1 procollagen 합성 촉진 활성 평가를 수행하였다.

Fig. 1. Extraction and isolation of manufactured Uncaria gambir product.

Download Original Figure

세포 독성은 MMT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 기존의 방법을 수정하여 사용하였다(16). 세포 배양은 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/ streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 Dulbeccos's Modified Eagle's Medium(DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. MTT assay는 탈수소 효과작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MMT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MMT formazan(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl- tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미트콘 드리아의 능력을 이용한 검사법으로 MMT formazan의 농 도를 540 nm에서 ELISA plate reader(Tecan Austria GmBH, Grödig, Austria)를 이용하여 측정하였다.

배양액 안의 MMP-1 단백질의 함량은 시판 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정 하였다. 먼저 MMP-1 kit의 표준 용액은 1/2 희석하였고, 표준 용액 100 μL와 시료 100 μL를 MMP-1 ELISA kit의 micro plate 분주하고 100 μL horseradish peroxidase conjugate 를 첨가한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 완충 용액으 로 각 well을 5회 반복 세척하여 비결합 항원을 제거한 후 100 μL 의 chromogenic tetramethyl benzidine을 넣어 30분간 반응시켰다. 그 후 100 μL의 정지 시약을 넣고 15분 후에 450 nm에서 ELISA plate reader(Tecan Austria GmBH)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(17).

CCD-986sk 세포를 24-well plate에 5×10⁴ cell/well의 농도 로 접종한 후 24시간 배양하였다. 세포를 phosphate buffered saline(PBS)로 2회 세척한 후 무혈청 배양액을 첨가한다. 24시간 후 시료를 처리하고 48시간 동안 배양한다. 배양액 을 수집하여 측정에 사용하였다. 세포배양액 내의 콜라겐 합성 정도는 procollagen type I C-peptide assay kit(Takara Bio Inc.)를 사용하여 콜라겐의 함량을 측정하였다(18).

총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Denis 방법(19)에 따라 측정하였으며, 추출물 혹은 분획물을 1.0 mg/mL 농도로 조제한 후, 시료 50 μL와 Folin-Denis 시액 50 μL, 0.7 M 탄산나트륨 포화용액 50 μL를 차례로 넣은 다음 이것을 잘 혼합하여 실온에서 60분 방치한 후 UV/VIS 분광광도계 (Jasco V-710, Tokyo, Japan)로 750 nm에서 흡광도를 측정하 였으며, 표준물질은 gallic acid를 이용하여 표준곡선을 작 성하여 양을 환산하였다.

결과 통계처리는 SPSS 12.0(Version 12, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분 석(ANOVA, analysis of variance) 프로그램을 이용하여 Duncan’s multiple range test를 이용하여 통계적 유의수준 p<0.05에서 검증하였다.

건조된 아선약의 80% 메탄올 추출물에 대해 Diaion HP-20 수지를 충진한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 얻 어진 H₂O, 20% MeOH, 40% MeOH, 60% MeOH, MeOH 및 70% acetone 용리액에 대하여 human dermal fibroblast HS68 세포의 증식에 미치는 영향을 평가한 결과는 Fig. 2와 같다. 아선약의 80% 메탄올 추출물과 각 용매별 용리액 을 농도별로 처리한 후 HS68 세포를 48시간동안 배양하여 세포생존율을 측정한 결과, 아선약 80% 메탄올 추출물 및 각 용리액에서 25, 50, 100 μg/mL의 농도에서 세포생존율이 80% 이상으로 세포독성이 없는 것으로 나타났으므로 이들 농도에서 활성 평가를 수행하였다.

Fig. 2. Cell viability of HS68 fibroblast cells of gambir extract and eluates. Data are expressed as the mean value±SD (n=3) of triplicate experiments.

Download Original Figure

Collagen은 피부세포의 결합 조직을 구성하는 주요 성분 중 피부 건조 중량의 약 70-80% 정도를 차지하는 주요 구성 단백질이다. 그러므로 인체 결합조직에서 collagen의 분해 는 피부의 탄력저하와 주름생성 등에 직접적인 영향을 미친 다. 인체에서 생성되는 여러 종류의 MMP들 중에 MMP-1은 collagen에 특이하게 작용하는 단백질 분해효소로서 MMP-1을 저해 하는 것으로, 이는 생체의 collagen의 분해를 감소시키며 피부조직의 탄력을 강화하고 주름생성을 방지 할 수 있는 좋은 전략으로 알려져 있다(20). 본 연구에서 아선약 및 각 용리액에 대한 MMP-1 저해활성을 평가한 결과(Fig. 3), 아선약 80% 메탄올 추출물은 50 μg/mL의 농도 에서 27.1±1.2%의 저해활성을 나타내었으며, Diaion HP-20 수지를 활용한 칼럼크로마토그래피 용리액 중 40% MeOH 용리액에서 IC₅₀값은 15.6±1.3 μg/mL의 우수한 활성을 나타 내었으며, 이 활성은 positive control로 사용된 녹차의 주름 개선 성분인 (-)-epigallocatechin gallate(EGCG)의 IC₅₀값은 38.4±2.3 μg/mL 보다 우수한 활성이었다. 한편, 20% MeOH, 60% MeOH 및 70% acetone 용리액은 50 μg/mL의 농도에서 각각 16.7±1.3%, 20.3±1.5% 및 17.2± 1.1%의 상대적으로 약한 저해활성을 나타내었다. 최근 flavonoid, stilbenoid, lignan 등의 페놀성 화합물은 MMP-1 저해 활성을 나타내는 주요성분(18,21,22)으로 보고 되어져 있으며, 이들 보고를 근거로 하여 페놀성 화합물의 함량과 MMP-1 저해활성과 의 연관성을 평가한 결과, Table 1에서 나타낸 것처럼, MMP-1 저해활성이 우수한 40% MeOH 용리액에 총페놀성 화합물의 함량이 99.4±5.7 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, 40% MeOH 용리액에 MMP-1 저해활성이 positive control보 다 강한 우수한 페놀성 화합물의 존재를 시사하였다. 현재 까지의 연구결과에 의하면 천연에 광범위하게 존재하는 페놀성 화합물의 일종인 플라보노이드계 화합물 중 MMP-1에 효과적인 물질로, 황금(Scutellaria baicalensis)의 flavone glycoside인 baicalin(23), 녹차(Camellia sinensis)의 주요flavan-3-ol 화합물인(-)-EGCG(24), 과일 및 채소에 함유 되어 있는 anthocyanin 화합물(25) 등이 알려져 있다. 이들 보고된 화합물 이외의 아선약에 존재하는 페놀성 화합물의 주름개선 효능과 관련된 MMP-1의 저해활성성분의 분리 및 동정을 통한 추가적 연구가 필요하다고 사료된다.

Fig. 3. Inhibitory effects of the tested sample of gambir on MMP-1. EGCG was used as a positive control. Data are expressed as the mean value±SD (n=3) of triplicate experiments. The different letters indicate significant differences determined by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Download Original Figure

피부상피세포 건조중량의 약 70-80%를 차지하는 주요구 성 성분인 collagen은 elastin 및 hyaluronic acid와 함께 피부 의 탄력 및 주름관련 주요 성분으로 알려져 있다. 일반적으 로 피부에서 type 1 collagen의 합성과 분해 효소의 하나인 MMP-1의 활성이 균형을 이루고 있지만, 내외부적인 요인 에 의하여 피부 노화가 진행되는 피부조직에서는 type 1 collagen의 합성이 저하되고 MMP-1의 효소 활성이 증가되 는 것이 알려져 있다(26). 그러므로 collagen 합성 촉진 효능 은 주름 방지를 위한 효과적인 방법이라 판단된다. 본 연구 에서 아선약의 type 1 collagen의 합성 촉진 효능평가를 수행 한 결과(Fig. 4), 아선약의 80% 메탄올 추출물의 EC₅₀값은 25.8±1.4 μg/mL의 효능을 나타내었고, Diaion HP-20 수지 를 활용한 칼럼크로마토그래피 용리액 중 40% MeOH 용리 액 경우 EC₅₀값이 6.9±0.7 μg/mL의 상대적으로 강한 활성을 나타났다. 양성대조구인 (-)-EGCG의 EC₅₀값이 5.5±0.9 μ g/mL과 비교해볼 때 40% MeOH 용리액 경우는 우수한 효능을 나타냄을 확인하였다. 한편, 20% MeOH, 60% MeOH 및 H₂O 용리액의 EC₅₀값은 각각 10.2±1.4 μg/mL, 12.7±0.6 μg/mL 및 12.8±1.2 μg/mL의 상대적으로 약한 type 1 collagen 합성 촉진 활성을 나타내었다. 최근 천연소재로 부터 type 1 procollagen 생합성능이 우수한 주름개선 소재 발굴을 위하여 진행된 연구에 의하면 때죽나무(Styrax japonica)의 triterpenoid인 erythrodiol-3-acetate은 1 μM에서 223.7±11%의 type 1 procollagen 증가를 유도하였으며(27), 강황 추출물의 경우 0.5 μM에서 196%의 type 1 procollagen 증가를 유도하였으며, 활성성분은 sesquiterpenoid인 xanthorrhizol로 동정하였다(28). 이상의 결과 및 최근의 type 1 procollagen 생합성 촉진 활성과 관련된 화합물의 aglycone은 대부분이 terpenoid 유도체가 주로 보고(29,30) 되어져 있으나 아선약의 활성성분으로 추정되는 페놀성 화합물(10,12)의 분리, 동정 및 활성기작 평가를 통하여 아 선약 추출물의 우수한 주름개선 소재로서의 추가적인 연구 가 필요하다고 사료된다.

Fig. 4. Effects of the isolated constituents on Type I collagen synthesis in UVB-ir radiated human fibroblast cells. UV (20 mJ/cm²)-exposed cells were cultured for 48 h in the presence of tested samples. EGCG was used as a positive control. Data are expressed as the mean value±SD (n=3) of triplicate experiments. The different letters indicate significant differences determined by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Download Original Figure

아선약의 함수 메탄올 추출물 및 각 용리액이 함유하고 있는 총페놀성 화합물의 함량을 Table 1에서 나타내었으며, 아선약 80% 메탄올 추출물은 1 g당 68.7±3.1 mg의 총페놀 성 화합물의 함유량을 확인하였다. Diaion HP-20 수지를 활용한 용리액의 경우 40% 메탄올 용리액이 68.7±5.7 mg/g 의 가장 높은 함량을 나타내었으며, 60% 메탄올 용리액 > 20% 메탄올 용리액 > 메탄올 용리액 > H₂O 용리액 > 70% acetone 용리액의 순으로 총페놀성 화합물 함유량이 감소함을 확인하였다. 이상의 결과로부터 아선약 함수 메 탄올 추출물의 MMP-1 저해 및 type-1 procollagen 합성 촉진 활성은 Fig. 3, 4 및 Table 1에서 나타낸 것처럼 총페놀성 화합물 함유량이 상대적으로 높은 40% 메탄올 용리액 상태 에서 positive control인 (-)-EGCG 보다 우수하거나 동일한 수준의 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있었으며, 아선약 의 80% 메탄올 추출물의 MMP-1 저해 및 type-1 procollagen 합성 촉진 활성과 페놀성 화합물 함량 사이에는 밀접한 상관관계가 있음을 시사하였다.