전통 장류 유래 유산균을 이용한 콩 발효물의 품질특성

대두를 침지(20°C, 18 h)한 후, autoclave를 이용하여 증자 (100°C, 2 h)하였으며, 증자된 콩을 방냉(40°C이하) 하였다. MRS broth(Difco, Sparks, MD, USA)로 전 배양된 유산균 (OD(600 nm): 0.5, 10⁸ CFU/mL)을 증자콩에 1% 접종(v/w) 하여 발효(RH70%, 37°C, 36 h) 시료를 제조하였다. Control 의 경우, 균을 접종하지 않고 동일한 조건에서 발효 (RH70%, 37°C, 36 h)하여 시료로 사용하였다. 본 실험에 사용 된 균주는 전통 장류 유래 유산균주로 통성혐기성의 특성을 가지며 exopolysaccharide 생성, 항균활성, 내산성, 내담즙성 활성을 나타내는 프로바이오틱 효과 우수 균주인 Lactococcus lactis I13, Lactobacillus plantarum JSA22, L. brevis JSB22를 이용하였다(12).

콩 발효물 20 g에 증류수를 가하여 100 mL이 되도록 정용하고 균질화한 후, 이를 원심분리(8,000 ×g, 10 min)하 여 상등액을 시료 추출액으로 사용하였다.

총 균수와 유산균수 측정은 각 시료 1 g을 멸균 생리식염 수를 이용하여 10진 희석법에 의해 10단계로 희석한 후, 희석액을 총 균수는 plate count agar(Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하여 배양(37°C, 24 h) 한 후, 결과를 계수 하여 측정하였고, 유산균수는 MRS agar(Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하여 gas pack(Oxoid, Hampshire, England)을 이용하여 혐기조건으로 배양(37°C, 48 h)한 후, 결과를 계수 하여 colony forming unit(log CFU/mL)로 나타내었다.

Protease의 활성은 Kim 등(13)의 방법을 변형하여 측정하 였다. 시료 추출액 1 mL에 0.6% casein기질용액(0.2 M phosphate buffer, pH 7.0)를 넣고 37°C에서 10분간 반응시켰 다. 반응 후 0.44 M trichloroacetic acid(TCA) 5 mL를 넣어 반응을 중지시켰다. 실온에서 30분간 방치한 다음 여과지 (No.2, Whatman, Buckinghamshire, UK)에 여과한 여액 2 mL에 0.55 M Na₂CO₃용액 5 mL와 4배 희석된 Folin reagent 용액 1 mL를 넣어 실온에서 30분간 반응시킨 후, 660 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 tyrosine(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 단계적으로 희석하여 동일한 방법으로 분석된 standard curve를 이용하여, 1 unit은 1분 동안 tyrosine 1 μg을 유리시키는 양을 환산하여 나타내었다.

α-Amylase활성 측정은 DUN(Dextrinogenic unit of nagase) 법에 의하여 측정하였다(5). 1% 가용성전분(in 0.02 M phosphate buffer, pH 7.0) 3 mL에 시료 추출액 1 mL 첨가하 여 40°C에서 10분간 반응시킨 후, 1 M HCl 10 mL를 가하여 반응을 중지시켰다. 요오드 용액(0.005% I₂＋0.05% KI) 10 mL을 넣고 발색시킨 후, 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험을 1 M HCl 10 mL를 넣어 반응을 중지후 시료추출액 을 넣어 반응 시킨 후, 발색시켜 측정하였다. 조효소액 1 mL이 1분 동안 전분 0.1 mg을 분해한 양을 1 unit으로 계산 하였다.

아미노태 질소 함량은 Formol 적정법(14)으로 측정하였 다. 시료 추출용액 5 mL, 중성 formalin용액 10 mL 및 증류 수 10 mL을 혼합한 용액에 0.5% phenolphthalein용액 2-3방 울 가한 후, 이에 0.1 N NaOH를 가하여 미홍색이 될 때까지 의 적정량과 blank test의 적정량을 이용하여 산출하였다.

환원당 함량은 dinitrosalicylic acid(DNS)법(15)으로 측정 하였다. DNS 시약 3 mL과 희석한 시료 추출용액 1 mL를 가하고 37°C, 5분간 반응 후, 냉각시킨 다음 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, glucose를 이용한 표준곡선으로부 터 환원당 함량을 산출하였다.

유리 아미노산함량은 Lee 등(16)의 방법을 이용하여 측 정하였다. 시료 3에 70% ethanol 30 mL를 가하여 균질화(1 h)한 후, 원심분리(21,000 ×g, 15 min) 하였다. 상등액을 70% ethanol 25 mL로 2회 반복 추출하고 추출액을 합하여 감압 농축하였으며, 이를 0.02 N HCl 20 mL에 녹이고 10배 희석하여 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 아미노산 자동분석기(Blochrom 30, Biochrom Ltd., Cambrdge, UK)를 이용하여 분석하였다.

유기산 함량 분석을 위한 시료 3 g을 50 mL volumetric flask에 넣고 증류수 30 mL을 첨가한 후 한 시간 동안 균질 화 하였다. 실온으로 식힌 후 증류수 가하며, 50mL로 정용 하고 filter paper로 여과한 후 0.45 μm filter로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 유기산 표준물질은 시료와 동일 하게 처리한 후 검량선 작성의 시료로 사용하였다. 유기산 분석을 위한 기기는 HPLC(Agilent technologies, Palo alto, CA, USA), column은 cap cell pak C18-AQ(Phenomenex, Torrance, CA, USA), detector는 UV 210 nm, mobile phase는 0.1 M NH₄H₂PO₄(pH2.5)를isocratic 조건으로사용하였으며, flow rate 는 1.0 mL/min의 조건으로 분석하였다.

시료 2 g에 추출용매(diethyl ether: pentane=1:1) 10 mL을 가하여 진탕추출(20°C, 15 h)한 후, 원심분리(10,017 ×g 10 min)하였고 상등액에 sodium sulfate 1 g을 첨가하여 수분을 흡착시켰다. 상등액을여과(No. 2, Whatman, Buckinghamshire, UK)한 후, 여액을 0.2 μm syringe filter(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)로 반복 여과하여 분석 시료로 사용하 였다. 향기 성분 분석은 GC/MS(QP2010, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하였고, 컬럼은 HP-innowax(60 m/ID 0.25 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 오븐온도는 40°C에서 5분 동안 유지한 후 1분당 2°C씩 230°C까지 상승 시켰고, 30분 동안 유지하였다. Injection온도는 250°C, carrier gas는 헬륨(He)을 이용하였고, 이동상 유속은 0.74 mL/min로 하였다. 화합물 동정은 GC-MS로 얻은 mass spectrum을 Wiley275 data base로 검색하여 동정하였다. 정 량분석을 위하여 각 화합물의 함량은 50 ppm 농도의 내부 표준물질 4-methyl-2-pentanol(Sigma Co.)을 이용하여 정량 하였다.

실험결과는 3회 반복으로 측정하였으며, 평균치간의 유 의성 검증은 SPSS system(Statistical Pack-age for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) soft-ware package (version 12)를 이용, p<0.05수준으로 Duncan’s multiple range test에 의하여 검정하였다.

콩 발효물의 일반세균수와 유산균수를 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 일반세균수는 control이 1.12×10⁸ CFU/mL으 로 가장 낮았으며, 유산균을 접종한 콩 발효물은 4.10×10⁹ -7.75×10⁹ CFU/mL으로 높게 나타났다. 또한 유산균수를 측정한 결과, 균을 접종하지 않은 control이 1.40×10⁸ CFU/mL로 측정되었으며, 유산균을 접종한 콩 발효물은 2.85×10⁹-4.35×10⁹ CFU/mL로 높게 나타났다. 유산균 종류 에 따른 균수 차이는 나타나지 않았으며, 콩에 유산균이 우점 하여 발효가 잘 되었음을 확인할 수 있었다. Yang 등(6)은 두유에 유산균과 고초균을 혼합 접종하였을 때, 총균수의 변화는 유산균만 접종한 군은 1.02×10⁸ CFU/mL, 혼합 접종한 경우 4.09×10⁸ CFU/mL으로 더 높았다고 보고 하였다.

Fig. 2. Total aerobic and lactic acid bacteria count of fermented soybean products by lactic acid bacter ia isolated from fermented soybean paste. (A), total aerobic; (B), lactic acid bacteria. Control, no inoculation; I13, Lactococcus lactis I13; JSA22, Lactobacillus plantarum JSA22; JSB22, L. brevis JSB22. Error bars represent standard deviations (n=3). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different (p<0.05).

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유산균을 접종한 콩 발효물의 α-amylase와 protease 활성 을 측정한 결과는 Fig. 3과 같다.

Fig. 3. Enzyme activity of fermented soybean products by lactic acid bacteria isolated from fermented soybean paste. (A), amylase activity; (B), protease activity. Control, no inoculation; I13, Lactococcus lactis I13; JSA22, Lactobacillus plantarum JSA22; JSB22, L. brevis JSB22. Error bars represent standard deviations (n=3). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different (p<0.05).

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α-amylase 활성 측정 결과, control은 33.39±0.21 unit/mL 으로 가장 높았으며, I13과 JSA22를 접종한 콩 발효물은 1.05±0.91, 3.13±1.39 unit/mL으로 가장 낮았다. 또한 JSB22 는 12.56±1.39 unit/mL으로 유산균 접종 콩 발효물 중 가장 높았다. 콩 발효물의 외관의 경우, control이 유산균을 접종 한 콩 발효물보다 점질물이 많이 형성된 것으로 보아 이는 자연발효로 제조된 청국장과 유사한 외형을 보였다(Fig. 1). Control의 경우, 균주를 접종하지 않은 자연 발효된 청국 장의 형태로 미생물 분포가 유산균뿐만 아니라 Bacillus sp.이 상당히 존재 할 것으로 예측된다. Lee 등(5)은Bacillus sp.로 제조된 콩 발효물의 경우, 18.45-20.82 unit/mL의 α -amylase 활성을 보고한 바 있다.

Fig. 1. Pictures of soybean fermented by lactic acid bacter ia isolated from fermented soybean paste. (A), Control; (B), Lactococcus lactis I13; (C), Lactobacillus plantarum JSA22; (D), L. brevis JSB22.

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Protease 활성 측정 결과 control이 333.13±17.68 unit/mL 으로 가장 높았으며, 유산균 접종 콩 발효물은 JSB22 접종 콩 발효물이 166.67±2.37 unit/mL으로 높았다. Ju와 Oh(17) 의 연구에서 유산균과 혼합 배양한 청국장의 protease활성 이 B. subtilis 균주 단독배양 청국장에 비해 낮게 나타난 결과가 혼합 배양 시B. subtilis 균주의 생육이 다소 억제되 기 때문이라고 보고하였다. 본 연구서도 control이 유산균을 접종한 콩 발효물보다 효소활성이 높게 나타난 것은 유산균 을 접종한 콩 발효물은 유산균이 우점종이 되었으나 control 은 유산균 외의 Bacillus 속 등의 미생물이 자연 접종되어 효소활성이 높게 나타난 것이라고 사료된다.

유산균 접종 콩 발효물의 환원당과 아미노태 질소함량을 측정한 결과는 Fig. 4, 5와 같다. 환원당 함량을 측정한 결과, 효소활성과 관련하여 control(2.12±0.05%)이 가장 높았고, 유산균 접종 콩 발효물은 JSB22가 1.23±0.035%로 가장 높 았다. 아미노태 질소 함량 또한 control(142.65±3.87 mg%) 이 가장 높았고 유산균을 접종한 콩 발효물 JSB22가 94.52±3.86 mg%으로 다른 유산균을 접종한 콩 발효물 보다 높게 나타났다. 이는 amylase와 protease의 활성과 유사한 경향을 보였으며, 이는 발효과정 중 미생물에 의해 생성 또는 분해되는 당과 아미노산 생성량과 연관이 있을 것으로 사료된다.

Fig. 4. Reducing sugar contents of fermented soybean products by lactic acid bacter ia isolated from fermented soybean paste. Control, no inoculation; I13, Lactococcus lactis I13; JSA22, Lactobacillus plantarum JSA22; JSB22, L. brevis JSB22. Error bars represent standard deviations (n=3). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different (p<0.05).

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Fig. 5. Amino type nitrogen contents of fermented soybean products by lactic acid bacter ia isolated from fermented soybean paste. Control, no inoculation; I13, Lactococcus lactis I13; JSA22, Lactobacillus plantarum JSA22; JSB22, L. brevis JSB22. Error bars represent standard deviations (n=3). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different (p<0.05).

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유산균을 접종한 콩 발효물의 아미노산함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 측정 결과 총 아미노산 함량은 15.88-17.62% 범위였다. 유산균 콩 발효물의 경우, glutamic acid(2.90-3.30%)가 가장 높게 검출되었으며, aspartic acid(1.78-2.01%), arginine(1.30-1.46%), leusine(1.28-1.44%) 의 순서로 높게 나타났다. Control의 경우, glutamic acid, aspartic acid, leusine, arginine의 순서로 검출되어 유산균을 접종한 콩 발효물과 유사한 결과를 나타내었다. Song과 Jung(18)의 연구에서 유산균을 이용한 콩 발효물의 아미노 산 함량변화를 측정한 결과, 모든 시료에서 glutamic acid, aspartic acid, leusine, arginine 순으로 많이 함유하고 있으며, glutamic acid와 aspartic acid 2종이 전체 아미노산 함량의 30% 정도를 차지하고 있다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사하였다. Park등(19)의 연구에서B. natto를 사용한 청국 장은 phenylalanine, tyrosine, lysine, leucine의 순서로 검출 되었고, B. subtilis BC-P1유래 청국장은 phenylalanine, glutamic acid, tyrosine, valine순이었다고 보고하였다. 그리 고 Mann 등(20)의 연구에서B. subtilis MC 31에 의해 발효된 청국장의 경우 아미노산 함량이 leucine, phenylalanine, lysine, valine, tyrosine 순으로 낮아졌다고 보고하여 두 연구 보고는 본 연구와는 상이한 결과를 나타냈다. 이러한 결과 를 통해 발효 균주에 따라 콩 발효 중 생성되는 아미노산이 다름을 알 수 있으며, 유산균을 이용한 발효와 Bacillus 속 균주를 이용한 콩 발효에서 아미노산 함량의 차이가 있음을 확인하였다.

유산균 콩 발효물의 유기산 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다, control의 경우 succinic acid(600.15 mg/100 g) 와 oxalic acid(63.57 mg/100 g) 만 검출되었으며, 유산균을 접종하여 발효한 콩 발효물의 경우 lactic acid가 816.17- 3,654.55 mg/100 g으로 가장 많은 함량을 나타내었고, oxalic acid가 22.74-33.54 mg/100 g 다음으로 많았다. Control을 제외하고 모든 군에서 succinic acid는 검출되지 않았으며, control에서는 lactic acid가 검출되지 않았다. Youn 등(21)의 연구 보고에서는 B. subtilis를 접종한 청국장에서는 acetic acid와 lactic acid의 함량이 특이적으로 높았으며B. natto에 서는 citric acid 와 succinic acid가, B. licheniformis에서는 malic acid가 상대적으로 높은 함량을 나타내었다고 보고하 였고, Kim등(22)의 연구에서B. natto로 발효시킨 청국장에 서 citric acid, acetic acid, pyroglutamic acid의 유기산이 검출 되었다고 보고하여 본 연구 결과와는 상이하였다. 이러한 차이는 발효 균주 차이에 기인하는 것으로 판단되며, 발효 중 생성된 유기산은 유해 균주에 대한 항균효과 및 다양한 풍미에 영향을 주는 것으로 사료된다.

유산균을 접종한 콩 발효물의 향기분석 측정 결과 Table 3.과 같다. 총 39종(ester류 2종, ketose 5종, alcohol 7종, hydrocarbons 14종, heterocyclic compounds 3종, acid 4종, other 5종)이 검출되었다. I13을 접종한 콩 발효물에서 23종 의 향기성분이 검출되었고 JSA22를 접종한 콩 발효물 에서 34종의 향기성분이 JSB22를 접종한 콩 발효물 에서는 19종 의 향기성분이 검출되었다. 세 가지 균주에서 공통적으로 검출된 향기 성분은 formic acid, ethyl ester, acetic acid ethyl ester, 2-butanol, 2,3-butanediol, cyclohexane, methyl-, heptane, benzene, benzene, chloro-, trans-9- fluoro- 2,2,3,3- tetramethoxy- 7,7-dimethyl –1-oxaspiro [3,5] non- 5- ene, hexadecane, naphthalene, pyrrolidine, 1-(1- isobutyl- 3-methyl-1- butenyl)-, disulfide, dioctyl, diethyldisulfide 총 14종 이였으며 그 중에서도 benzene(81.43-98.54 ppm) 과 acetic acid, ethyl ester(44.79-56.74 ppm)가 많이 검출되었다. I13과 JSA22 접종 구에서 공통적으로 7종의 향기성분이 검출되었으며 그 중에서도 propane(I13: 95.23 ppm, JSA22:　 97.33 ppm)이 가장 많이 검출되었다. 여러 보고에 따르면 Bacillus 속으로 제조된 청국장과 natto의 특이한 향기성분 으로 알려진 pyrazine류 화합물인 di-, tri-, tetramethylpyrazine 화합물이 주로 검출된다고 보고되었다(21.23). 본 연구의 유산균을 이용한 콩 발효물에서는 pyrazine류의 화합물이 검출되지 않았으며, 유산균주 별 콩 발효물의 향기성분이 분석 된 바 없기 때문에 균주에 따른 향기특성 기초자료로 유용할 것으로 사료된다.