긴병꽃풀의 생리활성과 이를 첨가한 양갱의 품질특성

본 연구에 사용된 긴병꽃풀은 2014년도 4월에 대구 팔공 산 인근 들판에서 직접 채취하여 이물질을 제거한 후 사용 하였으며, 백앙금(Goodmorning Seoul, Seoul, Korea), 분말 한천(MSC, Yangsan, Korea), 올리고당(CJ CheilJedang, Incheon, Korea) 및 소금(SajoHaepyo, Seoul, Korea)은 시중 에서 구입하여 사용하였다.

긴병꽃풀 분말은 50°C drying oven에서 건조하여 40 mesh 크기로 분쇄하였으며, 4°C에서 저온 저장하며 시료로 사용 하였다. 추출물 제조는 열수추출물의 경우 긴병꽃풀 분말 1 g에 증류수 200 mL를 가하고 100 mL가 될 때까지 가열하 여 끓인 후 상온에서 120 rpm으로 교반 추출하였으며, ethanol 추출물은 긴병꽃풀 분말 1 g에 100 mL의 70% ethanol을 추출용매로 가하여 24시간 동안 상온에서 120 rpm으로 교반 추출하였다. 추출액은 Whatman No. 41 filter paper(GE Helathcare Life Science, New York, NY, USA)로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator(BUCHI, Uster, Switzerland)로 농축하여 시료로 사용하였다.

총 페놀성 화합물(total phenolic content, TPC) 정량은 Folin-Denis 방법(16)에 준하여 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent(Junsei, Tokyo, Japan) 0.5 mL를 섞어 Na₂CO₃ 1 mL를 가하여 1시간 동안 암실에 방치한 후, 725 nm의 파장으로 흡광도를 측정하여 gallic acid를 이용한 표 준곡선으로부터 양을 환산하여 mg gallic acid equivalent (GAE mg/g)으로 나타내었다.

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical에 대한 소거 활성은 Blois의 방법(17)에 준하여 측정하였으며, 전자공여 능(%)은 1-(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나 타내었다. 2,2’-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical cation decolorization의 측정은 Fellegrin 등의 방법(18)에 준하여 측정하였고, 저해율(%)은 1-(반응 구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다. Antioxidant protection factor (PF)는 Andarwulan과 Shetty의 방법(19)에 준하여 측정하였으며, PF는 (반응구의 흡광도/ 대조구의 흡광도)의 비로 나타내었다. Thiobarbituric acid reactive substance(TBARs) 측정은 Buege와 Aust의 방법(20) 에 준하여 측정하여 저해율(%)은 1-(반응구의 TBARs μM/ 대조구의 TBARs μM)×100으로 나타내었다.

Tyrosinase 저해활성은 Vincent와 Hearing(21)의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 2.3 mL와 기질액 1.5 mM L-tyrosine 용액 0.4 mL의 혼합액에 250 U/mL mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.1 mL와 50-200 μg/mL phenolic compounds 농도의 시료 0.2 mL를 넣고 대조 구는 시료 대신 증류수 0.2 mL를 넣어 37°C에서 20분간 반응시켜 흡광도 475 nm에서 측정하여, 저해율(%)은 (1-시 료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하였다.

Hyaluronidase(HAase) 저해활성은 Dorfman A의 방법 (22)에 준하여 측정하였다. 반응구는 시료 0.5 mL에 20 mM sodium phosphate buffer(pH 6.9)에 녹인 HAase(1,000 U/mL) 0.5 mL을 혼합하여 38°C에서 5분간 반응시키고 0.3 M phosphate buffer(pH 5.3)에 녹인 기질(4 mg/mL) 0.5 mL을 넣어 다시 38°C에서 45분간 반응시킨 후 0.04 M acetate buffer(pH 3.75)에 녹인 알부민용액 5 mL을 첨가한 후 5분간 방치하고 600 nm에서 투과율을 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수 0.5 mL를 넣어 반응시켰다. 저해율(%)은 (1-시 료의 투과율/대조구의 투과율)×100으로 계산하였다.

긴병꽃풀 분말을 첨가한 양갱의 제조방법은 Kim 등(23) 의 방법을 참고하여 긴병꽃풀 분말의 첨가비율을 양갱에 첨가되는 앙금 대비 0.5, 1.0, 1.5, 2.0%로 정하였다. 양갱의 제조방법은 Table 1의 재료 배합 비율로 한천을 30분간 따뜻한 물에 불리고 85°C에서 가열하여 녹인 후, 소금, 긴병 꽃풀 분말(앙금대비 0.5, 1.0, 1.5, 2.0%)을 넣고 녹인다. 백앙 금, 올리고당을 넣고 약한 불에 5분 가열한 것을 양갱 틀에 부어 실온에서 굳힌 후, 4°C에서 15시간 냉각시키고, 실온에 서 1시간 동안 방치 시킨 뒤 사용하였다.

양갱의 색도는 색차계(JP/CR series, Minolta Co., Osaka, Japan)를 사용하여 명도(L, lightness), 적색도(a, redness), 황색도(b, yellowness)를 측정하였고, 각 처리군당 6개의 시 료를 사용하여 평균값을 이용하였다.

양갱의 기계적 조직감은 rheometer(Compac-100, Sun Science Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 경도(hardness), 탄력 성(springiness), 응집성(cohesiveness), 씹힘성(chewiness)을 측정하였고, 측정 시 사용된 조건은 test type: texture, sample height: 10 mm, sample width: 15 mm, adaptor type: circle, adaptor area(diameter): 5 mm, table speed: 120 mm/min이다.

긴병꽃풀 분말을 첨가한 양갱의 관능적 기호도 평가는 냉장 보관된 양갱을 실온에 방치하여 일정한 크기(15 mm×15 mm×10 mm)로 절단하여 식품응용공학과 학생 19 명을 대상으로 실시하였다. 평가항목으로는 맛, 향, 점성, 경도, 씹힘성, 탄력성, 전체적 기호도로 분류했으며, 5점척 도법(1점, 매우 싫다; 2점, 약간 싫다; 3점, 좋지도 싫지도 않다; 4점, 약간 좋다; 5점, 매우 좋다)을 사용하여 평가하였 다.

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리 는 IBM SPSS statistics ver. 22 for windows(IBM Corp., Armonk, New York, NY, USA)를 이용하여 평균±표준편차 (mean±SD)로 표시하였고 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하여 시료간의 유의차를 p<0.05 수준으로 비교 분석하였다.

식물체에 함유되어있는 페놀성 화합물들은 식물체의 2 차 대사산물로서 항암, 항산화 작용, 정장작용, 콜레스테롤 저하작용 등의 다양한 생리활성 기능을 가지고 있다. 이들 은 다양한 구조와 분자량을 가지고 있어 생리활성 또한 매우 다르게 나타나는데, 이것은 분자내의 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대분자들과 결합하는 특성이 있어 뛰어난 활성을 나타낸다. 항산화 작용과 관련 하여 최근 생체 내에서의 산소 free radical 반응이 생체조직 의 노화나 질병과 관련이 있으며, 페놀성 물질의 hydroxyl group은 유지의 유리기 수용체로서 유지 산패의 초기 단계 에 생성된 유리기들이 안정된 화합물을 형성하도록 하여 항산화 작용을 한다고 알려져 있다(24). 본 연구에서는 이러 한 생리활성 기능을 가지는 페놀성 화합물을 추출하기 위하 여 식품에 적용할 수 있는 용매로 물과 ethanol을 이용하여 추출해서 gallic acid 표준곡선을 이용하여 정량하였다. 그 결과 Fig. 1에서와 같이 열수추출물에서 12.99 GAE mg/g으 로 가장 높은 추출 수율을 나타내었고, ethanol에서 3.14 GAE mg/g의 용출량을 나타내었다.

Fig. 1. Content of phenolics in water and ethanol extracts from Glechoma hederacea. ***, p<0.001.

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DPPH radical 소거능 측정은 안정한 형태의 DPPH radical 에 시료의 페놀성 화합물이 수소공여작용을 통하여 DPPH-H 의 형태로 환원시키면 흡광도가 감소하는 것을 이용한 항산 화 효과 검증 방법이다(25). 긴병꽃풀 추출물의 전자공여능 을 측정한 결과 Fig. 2A에서와 같이 열수추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 77.16-78.24%의 전자공여능을 나 타내었고, 70% ethanol 추출물에서는 73.04-77.00%로 나타 내었다. Positive control로 사용한 BHT에서는 50-200 μg/mL 의 농도에서 23.78-64.72%로 긴병꽃풀 추출물보다 비교적 낮은 전자공여능을 나타내었다. Kim 등(26)은 모시풀잎 70% ethanol 추출물을 52.5 μg/mL 농도로 측정한 결과 71.6%의 전자공여능을 나타내었다고 보고한 결과에 비해 긴병꽃풀의 전자공여능이 더 우수하다고 판단되었다. 긴병 꽃풀 추출물의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 Fig. 2B에서와 같이 열수추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에 서 84.35-99.75%의 radical 소거능을 나타내었고, 70% ethanol 추출물에서는 83.74-99.55%로 50-100 μg/mL의 구 간에서는 증가하였으나, 더 높은 농도에서는 유의적 차이 를 나타내지 않았다. Bae 등(27)은 62.5 μg/mL 농도의 생강 열수, 80% ethanol 추출물에서 각각 59.7%, 39.0%의 소거능 을 나타내었다고 보고한 결과와 비교하였을 때 긴병꽃풀의 ABTS radical 소거능이 더 우수하다고 판단되었다. Positive control로 사용한 BHT에서는 50-200 μg/mL의 농도에서 26.09-90.97%의 소거능을 나타내어 긴병꽃풀 추출물이 합 성항산화제를 대체할 수 있는 소재로 적합하다고 판단되었 다. β-Carotene linoleate system을 통한 항산화 효과의 측정 방법은 지방산패의 특징을 이용하여 불포화지방산으로부 터 생성된 free radical이 β-carotene의 특징적인 색을 감소시 키는 것을 측정하는 방법(28)으로 긴병꽃풀의 지용성 항산 화 효과를 측정하는 antioxidant protection factor(PF)를 측정 한 결과 Fig. 2C에서와 같이 열수추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 1.54-1.62 PF를 나타내었고, 70% ethanol 추 출물에서는 1.62-2.09 PF를 나타내어 50-200 μg/mL의 농도 에서 1.25-1.68 PF를 나타낸 BHT보다 더 우수한 효능을 나타내었다. Park 등(29)은 약용식물인 지유, 천문동, 천련 자, 청피 열수추출물을 200 μg/mL의 농도로 측정한 결과 각각 0.9, 1.7, 1.3, 1.1 PF를 나타내었다고 보고한 결과와 비교하였을 때, 긴병꽃풀 추출물의 지용성 항산화 효과가 더 우수하다고 판단되었다. 지방의 자동산패 과정에서 생 성된 free radical은 산소와 반응하여 과산화물인 peroxy radical을 생성한다. 이것은 다시 여러 반응을 거쳐 hydroperoxide로 변하며 이는 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP)를 거쳐 결과적으로 malonic dialdehyde(MDA), ethane, pentane 등을 생성한다. Thiobarbituric acid reactive substance (TBARs)는 여기서 생성된 MDA를 thiobarbituric acid와 산 성 조건하에서 반응시켜서 특징적인 색을 나타내어 지방산 패 억제능을 측정하는 방법(30)으로 긴병꽃풀 추출물의 TBARs를 측정한 결과 Fig. 2D에서와 같이 열수추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 42.93-94.09%를 나타내었 고, 70% ethanol 추출물에서는 91.05-95.19%로 높은 활성을 나타내어 부작용을 발생시킬 수 있는 BHT보다 긴병꽃풀 추출물이 더 우수하다고 확인할 수 있었다. Jung 등(31)은 무 줄기, 뿌리 50% ethanol 추출물을 200 μg/mL의 농도에서 측정한 결과 각각 26.8, 37.7%의 TBARs를 나타내었다고 보고한 결과와 비교하였을 때, 긴병꽃풀의 지방산패 억제 능이 더 우수하다고 판단되었다.

Fig. 2. Antioxidant activity of water and 70% ethanol extract from Glechoma hederacea. A, DPPH; B, ABTS; C, antioxidant protection factor; D, TBARs. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by a Duncan’s multiple range test.

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Melanocyte는피부기저층에존재하는세포로서melanosome 을 통하여 melanin을 생성하고 melanin을 이용하여 태양 자외선으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 하지만 melanin의 생성이 과다하게 일어나면 흑생종과 피부 색소 침착 등을 일으킬 수 있어 생성량에 조절이 필요하다. 이 과정에서 가장 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosinase는 tyrosine을 산화시켜 3,4-dihydroxyphenylalanin(DOPA)를 생성하고 DOPA는 또 tyrosinase에 의하여 DOPA quinone으 로 변환된다. 이는 또 다른 단백질들의 작용에 의하여 최종 적으로 pheomelanin과 eumelanin으로 변환되어 turnover에 의하여 표피로 이동한다. 이 과정에서 melanin이 과도하게 쌓이면 색소침착이 일어나게 된다. 이처럼 tyrosinase는 melanin 생성 초기단계에서 가장 중요한 역할을 하는 효소 이기 때문에 미백 효과 측정에서 tyrosinase 저해활성이 가 장 많이 사용되고 있다(32). 긴병꽃풀 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 3에서와 같이 열수추출물에서 는 저해활성이 나타나지 않았으며, 70% ethanol 추출물에서 는 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 30.32-40.56%의 tyrosinase 저해활성을 나타내었다. Kojic acid는 tyrosinase의 활성을 저해하여 미백효과를 나타낼 수 있어 화장품에 사용되고있 는 물질로서 positive control로 사용하였다(33). Kojic acid에 서는 58.84-87.95%의 tyrosinase 저해활성을 나타내었다. Yoon(33)은 땅콩새싹 95% ethanol 추출물이 100 μg/mL의 농도에서 23.0%의 저해활성을 나타낸다고 보고한 결과와 비교하였을 때 긴병꽃풀 추출물의 tyrosinase 저해활성이 더 우수하였고 기능성 미백 화장품의 원료로도 이용 가능할 것으로 기대되어진다.

Fig. 3. Tyrosinase inhibitory activity of Glechoma hederacea extracts. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by a Duncan’s multiple range test.

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Hyaluronidase(HAase)는 hyaluronic acid의 glucuronic acid와 N-acetylglucosamine의 β-1,4 결합을 가수분해하는 효소이다. HAase에 의하여 생성된 분해생성물 혹은 저분자 의 hyaluronic acid는 염증을 유발하거나 fibrosis, collagen deposition을 증가시킨다고 알려져 있으며 항알러지 및 항 염증 약물인 disodium cromoglycate(DSCG), Tranilast, Traxanox 등에 의하여 그 활성이 저해됨이 보고되었다. 이 와 같이 염증과 HAase의 연관성이 알려져 있으며 HAase 활성저해는 다양한 물질의 항염증 활성 검색에 우선적으로 이용되고 있는 방법이다(34). 긴병꽃풀 추출물의 HAase 저 해활성을 측정한 결과 Fig. 4에서와 같이 열수추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 14.23-40.93%의 HAase 저해 활성을 나타내었고, 70% ethanol 추출물에서는 57.45-72.88 %의 저해활성을 나타내었다. Positive control로 사용한 PDTC(ammonium pyrrolidine di-thiocarbamate)는 50-200 μg/mL의 농도에서 5.49-98.21%의 저해활성을 나타내었다. Cho(35)는 쇠무릎 잎, 줄기, 뿌리 ethanol 추출물을 500 μg/mL의 농도로 HAase 저해활성을 측정한 결과 각각 21.01, 29.01, 32.12%의 저해활성을 나타낸다고 보고하였 다. 이와 비교하였을 때 긴병꽃풀의 HAase 저해활성이 더 우수하였고, 시판 중인 합성의약품의 부작용을 대체할 수 있는 천연물질로 이용할 수 있는 근거자료로 사용될 수 있다고 판단되었다.

Fig. 4. Hyaluronidase inhibitory activity of Glechoma hederacea. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by a Duncan’s multiple range test.

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긴병꽃풀 분말(0.5-2.0%)을 첨가하여 제조한 양갱의 색 도 측정결과 Table 2와 같이 명도를 나타내는 L 값은 대조군 이 48.92로 가장 높았고, 분말 첨가군의 농도에 따라 32.79-42.07의 범위로 대조군보다 낮게 나타났다. 따라서 긴병꽃풀 분말의 농도가 증가할수록 L 값은 감소하여 명도 가 낮아지는 경향을 나타내어, 분말 첨가군의 농도에 따른 유의적인 차이를 나타내었다. 적색도를 나타내는 a 값은 긴병꽃풀 분말의 첨가량이 증가함에 따라 유의적으로 감소 하는 결과를 나타내었다.

황색도를 나타내는 b 값은 긴병꽃풀 분말의 첨가군량에 관계없이 일정한 값을 나타내었다. 명도는 모든 구간에서 유사한 결과를 나타내었지만, a 값과 b 값에는 긴병꽃풀 분말이 어두운 녹색을 띠고 있어 첨가량이 증가하더라도 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타내었다. 긴병꽃풀 첨가 군의 색차를 측정한 결과, 대조군에 비해 분말 첨가군의 농도가 증가함에 따라 색차가 증가하는 결과를 나타내어 명도의 차이가 커짐으로 인해 발생한 결과로 예상되었다.

긴병꽃풀 분말을 첨가하여 제조한 양갱의 기계적 조직감 을 측정한 결과 Table 3와 같이 hardness는 대조군이 6.41 kg/cm²로 가장 높았으나 대조군과 1.0% 첨가군까지는 유의 적 차이를 나타내지 않았고, 1.5% 이상 첨가군에서는 유의 적 차이를 나타내었다. 이 결과는 부재료의 첨가량이 증가 하여 한천에 의한 응고력이 감소한 결과로 사료된다. Springiness는 대조군이 342.01%로 가장 높았으며, 1.5% 첨가군까지 springiness가 감소하다가 2.0% 첨가군에서는 일정한 결과를 보여 전체적으로 감소하는 경향을 나타내었 다. Cohesiveness는 대조군과 첨가군이 69.63-73.45%로 긴 병꽃풀 분말 첨가량에 따른 유의적 차이가 없는 것으로 나타내었다. Chewiness는 2.0%에서 169.53 g으로 가장 높 았으며 대조군과 긴병꽃풀 분말 첨가군 사이에는 유의적 차이를 나타내지 않았다. 긴병꽃풀 분말의 첨가는 양갱의 기계적 특성에 영향을 미치는 것으로 나타내어 관능적 기호 도에 따라 첨가량을 결정하는 것이 적합하다고 판단되었 다.

긴병꽃풀 분말을 첨가한 양갱의 관능적 기호도 평가는 Table 4와 같이 viscosity는 대조군이 2.8점으로 가장 높은 점수로 평가 받았으며, 첨가군은 2.4-2.7점으로 비교적 낮은 평가를 받았다. 이는 긴병꽃풀 분말이 양갱의 수분함량을 감소시켜 점도가 낮아진 결과로 판단되었다. Hardness는 대조군이 3.1점, 첨가군에서 2.9-3.1점으로 경도는 큰 차이 를 나타내지 않았다. Chewiness는 대조군이 3.6점으로 가장 높은 점수로 평가 받았으며, 첨가군은 2.6-3.2점으로 긴병꽃 풀 분말 첨가량이 증가할수록 씹힘성이 감소하는 경향을 나타내었다. Springiness는 대조군이 3.2점, 첨가군은 2.8- 3.0점으로 탄력성에는 큰 차이를 나타내지 않았다. Taste는 대조군이 3.7점으로 가장 높은 점수로 평가 받았으며, 첨가 군에서는 0.5%와 1.0% 첨가군이 비슷한 평가를 받았으며, 긴병꽃풀 분말의 첨가량이 증가함에 따라 taste 기호도가 감소하는 결과를 나타내었다. Flavor는 대조군이 3.1점, 첨 가군은 2.9-3.2점으로 향에는 큰 차이를 나타내지 않았다. Overall acceptabillity는 대조군이 3.5점으로 가장 높은 점수 로 평가받았다. 1.0% 첨가군이 두번째로 높은 점수를 받았 으며, 첨가량이 증가할수록 overall acceptabillity가 감소하 는 경향을 나타내었다. 긴병꽃풀 분말의 첨가는 식감의 기 호도에 많은 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 맛과 향에 의해 큰 기호도 차이를 나타내었다. 첨가량이 증가함에 따 라 기호도가 감소하는 경향을 나타내었지만, 1.0% 첨가군 에서는 기호도에 대해 높은 평가를 받았기 때문에 기호도를 해치지 않는 1.0% 이하의 분말을 첨가하는 것이 적합할 것으로 판단되었다.