마늘껍질 70% 에탄올 추출물의 인간 암세포 증식억제 활성

본 실험에 사용한 마늘껍질은 경남 창녕군 마늘공장에서 수거하였으며, 수거된 마늘껍질은 불순물과 분리 후 세척, 자연 건조하여 추출에 사용하였다. 70% 에탄올이 추출용매 로 이용되었다. 70% 에탄올 추출물은 시료 무게의 10배 용매를 가하여 실온에서 교반하면서 24시간 동안 추출하였 고, 같은 작업을 3번 반복하였다. 얻어진 추출액은 Whatman 1번을 이용하여 여과하였고 회전감압농축기(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용해 농축한 후, 20°C 냉동고에서 보관 하여 시료로 사용하였다.

본 실험에서 사용한 암 세포주는 인체유래 폐암 세포 A549, 위암 세포 AGS, 유방암 세포 MCF-7, 간세포 Hep3B 및 대장암 세포 HT-29를 사용하였고, 정상 세포주는 인체유 래 신장 세포인 HEK293을 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 U/mL penicillin G, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 RPMI 1640과 DMEM, EMEM medium을 사용하여 5% CO₂, 37°C 조건 배양기에서 배양하 였다.

추출물의 정상세포 및 암세포에 대한 독성은 Young 등 (12)의 방법에 따라 MTT assay로 확인하였다. 각 세포주를 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주하고 24시간 동안 배양 (37°C, 5% CO₂)한 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 각각의 시료 농도로 처리하여 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 후에 well당 20 μL의 MTT solution(1 mg/mL) 을 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 반응시 킨 후 MTT시약이 포함된 배지를 제거하고 DMSO 100 μL를 가한 후 상온에서 발색시키고 ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

A_test : 시료 첨가구의 흡광도

B_control : 시료 무첨가구의 흡광도

모든 데이터는 3회 반복 측정하였으며, 평균(mean)±표 준편차(SD)로 표시하였다. 실험 군 간의 통계학적 분석은 SPSS(Ver. 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 ANOVA 분석을 시행하였고, 유의차가 있는 항목에 대해서 는 신뢰구간 p<0.05에서 Duncan’s multiple range test를 실시 하였다.

마늘껍질 70% 에탄올 추출물(GPE)의 정상세포에 대한 독성을 측정하기 위해 인체 신장유래 정상세포(HEK 293) 를 사용하였고, 시료는 농도 100-2,000 μg/mL 범위에서 독 성 여부를 측정하였다. 그 결과, GPE는 조사된 모든 농도에 서 100% 이상의 높은 세포 생존율이 확인되어 조사된 시료 농도 100-2,000 μg/mL 범위에서 마늘껍질 70% 에탄올 추출 물은 정상세포에 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Viability of human normal cell line HEK293 treated with 70% ethanol extract of gar lic peels (GPE). Cells were treated with GPE (100-2,000 μg/mL) for 24 hr. Cell viability was determined by MTT assay. Mean±standard deviation from three independent experiments are shown. Bars with the same letters are not significant different at p<0.05.

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인체에서 유래된 폐암 세포(A549), 위암 세포(AGS), 유 세포생존율(%)=(방암 세포(MCF-7), 간암 세포(Hep3B) 및 대장암 세포(HT-29)를 이용하여 GPE가 각각의 암세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 이용 하여 암세포에 대한 성장 억제 활성을 측정하였다.

폐암 세포(A549)에 대한 성장 억제 활성 측정 결과, 200 μg/mL까지의 저 농도 처리에서는 A549 세포의 생존율이 100%로 증식 억제 효과가 나타나지 않았다(Fig. 2A). 반면 500 μg/mL 이상의 농도에서는 A549 세포의 생존율이 10% 이하로 떨어지면서 90%의 우수한 폐암 세포 증식 억제 활성이 확인되었다. Hoe 등(13)은 버섯 균사체 혼합 배양 추출물 처리에 대한 A549 세포의 생존율이 53%라고 보고 하였고, Lee 등(14,15)은 1,000 μg/mL 농도에서 홍경천 뿌리 및 캘러스 초음파 추출물의 세포 성장률이 37%, 매자나무 수피 추출물에 대한 생존율이 30%라고 보고하였다. 이들 결과와 비교할 때 500 μg/mL 농도에서 10% 이하의 폐암 세포 생존율을 확인한 마늘껍질 에탄올 추출물은 폐암 세포 에 대한 성장 억제 활성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.

Fig. 2. Inhibition of human cancer cell growth by addition of 70% ethanol extract of gar lic peels (GPE). (A), human lung cancer cell line A549; (B), human stomach cancer cell line AGS; (C), human breast cancer cell line MCF-7; (D), human liver cancer cell line Hep3B; (E), human colorectal cancer cell line HT-29. Cells were treated with GPE (100-2,000 μg/mL) for 24 hr. Cell viability was determined by MTT assay. Mean±standard deviation from three independent experiments are shown. Bars with the same letters are not significant different at p<0.05.

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인간의 위암 세포인 AGS에 대한 마늘껍질 70% 에탄올 추출물의 증식 억제 활성 조사 결과는 Fig. 2B와 같다. 위암 세포에 대한 GPE의 성장 억제 활성은 500 μg/mL 농도까지 100% 세포 생존율이 확인되어 증식 억제 효과가 없는 것으 로 확인되었으며, 1,000 μg/mL의 농도에서 45%의 증식 억 제율을 확인할 수 있었고, 최고 처리 농도 2,000 μg/mL에서 71%의 억제율을 확인하였다. Park 등(16)은 여지초 추출물 이 1,000 μg/mL 농도에서 57%의 생존율을, Kim(17)은 대추 잎 물 추출물 1,000 μg/mL 농도에서 78%의 위암 세포 생존 율을 보고하였다. 또한 콩 종류별로 암세포 증식 억제 효과 를 비교한 Lim(18)은 콩 메탄올 추출물이 1,000 μg/mL 농도 에서 50% 이상의 암세포 증식 억제 효과가 있다고 보고하 였다. 이들 결과와 비교할 때 마늘껍질 70% 에탄올 추출물 은 상대적으로 높은 위암세포 증식 억제 활성이 있는 것으 로 확인되었다.

유방암과 관련해 Challier 등(19)은 마늘 성분이 유방암에 효과적임을 밝힌바 있고, Ham 등(20)은 유방암 세포에 대해 500 μg/mL 농도의 산마늘 추출물에서 71.3%의 높은 증식 억제 활성을 보고하였다. 유방암 세포 MCF-7에 대한 GPE 의 증식 억제 활성은 폐암세포(A549)나 위암세포(AGS)에 대한 억제 활성보다 훨씬 우수한 것으로 확인되었다(Fig. 2C). 조사된 제일 낮은 농도인 100 μg/mL 농도에서는 GPE 가 유방암 세포의 증식을 억제하는 효과를 확인할 수 없었 으나 200 μg/mL의 저 농도에서 78%의 유방암 세포 억제율 이 확인되어 매우 우수한 유방암 세포 증식 억제 효과가 있는 것이 확인되었다. 500 μg/mL 이상의 농도 처리 결과에 서는 모두 90% 전후의 유방암 세포 억제율을 확인하였으며 농도에 따른 유의적 차이는 없는 것으로 확인되었다. 이러 한 결과는 Kim(17)이 500 μg/mL 농도에서 대추잎 70% 에탄 올 추출물에 대해 69%의 생존율을 보고한 것과, Kwon 등 (21)이 1,000 μg/mL 농도에서 상황버섯 균사체 에탄올 추출 물에 대한 암세포 생존율이 81%라고 보고한 것과 비교할 때, 마늘껍질 70% 에탄올 추출물은 저 농도에서도 매우 높은 유방암 세포 증식 억제 활성이 있는 것이 확인되었다.

농도별 GPE 처리에 대한 간암 세포(Hep3B)의 증식억제 활성을 조사한 결과는 Fig. 2D와 같다. 마늘껍질 70% 에탄 올 추출물이 100 μg/mL의 저 농도에서 다른 암세포의 증식 을 억제하지 못한 반면, 간암 세포의 경우 100 μg/mL의 저 농도 처리에서도 57%의 억제율이 확인되어, GPE의 매 우 우수한 간암 세포 증식 억제 활성이 확인되었다. 처리되 는 GPE의 농도가 증가함에 따라 500 μg/mL 농도까지 농도 의존적으로 간암 세포에 대한 증식 억제 활성은 증가되어 간암 세포의 생존율이 13%까지 저하되었으며, 500 μg/mL 이상의 농도에서는 처리 농도에 따른 유의적 차이는 없는 것으로 확인되었다. Lim(18)이 보고한 흑태, 서목태 및 서리 태 메탄올 추출물이 1,000 μg/mL의 상대적으로 높은 농도 에서 51%, 59% 및 52%의 증식 억제 효과를 확인한 반면, 본 연구에서 조사된 GPE는 100 μg/mL의 저 농도에서 57% 의 높은 생존 억제 효과가 확인되어 GPE가 다른 암세포보 다 특히 간암 세포에 대한 증식 억제 효과가 탁월함을 확인 하였다.

대장암 세포(HT-29)에 대한 증식 억제 효과는 유방암 세포(MCF-7)에서 확인된 GPE의 증식억제 활성 결과와 유 사하게 확인되었다. 100 μg/mL 농도 처리에서는 HT-29 세 포에 대한 증식 억제 효과가 확인되지 않았으며, 200 μg/mL 의 저 농도 처리에 15%, 500 μg/mL 농도 처리에서 85%, 1,000 μg/mL의 고농도 처리에서 93%의 대장암 세포 증식 억제율을 확인하였으며, 조사된 1,000 μg/mL 농도까지 농 도 의존적으로 대장암 세포에 대한 생장 억제 효과가 있는 것으로 확인되었고, 1,000 μg/mL 이상의 농도 처리에서는 농도에 따른 유의적 차이가 없는 것으로 확인되었다.