로스팅 칡 추출물의 항산화 활성

본 실험에 사용한 칡은 2015년에 전라남도 소재의 남원 원예농협으로부터 구매하여 사용하였다. 구매한 칡은 세 척, 건조, 세절 후에 1차 증숙 공정으로 증숙기에서 121℃, 30분 동안 증숙한 후, 건조온도 25℃의 건조기에서 1일간 건조하였다. 2차 증숙 공정으로 80℃의 증숙기에서 100분 동안 증숙 한 후, 25℃의 건조기에서 1일간 건조하였다. 건조된 칡은 세 가지 온도조건(150℃, 200℃, 250℃)에서 각각 10분, 20분, 30분 로스팅을 수행하였고, 35℃ 내에서 3일간 숙성하였다.

각각의 조건에서 로스팅한 칡을 원물에 10배수의 증류수 를 넣고 환류 추출장치에서 95℃의 온도로 6시간동안 추출 하였으며, 2회 실시하였다. 1차 및 2차에 얻어진 추출물을 혼합하여 filter paper(ADVANTEC, Tokyo, Japan)로 여과한 다음 일정농도(12±0.3 °Brix)까지 농축(VV20, Heidolph, Schwabach, Germany)한 후 동결건조(MCFD5510, Il-sin, Dongducheon, Korea)하여 열수추출 분말시료를 얻었으며, 이렇게 얻어진 분말시료는 control(칡 원물), PL-15-1(칡 15 0℃, 10분간 로스팅), PL-15-2(칡 150℃, 20분간 로스팅), PL-15-3(칡 150℃, 30분간 로스팅), PL-20-1(칡 200℃, 10분 간 로스팅), PL-20-2(칡 200℃, 20분간 로스팅), PL-20-3(칡 200℃, 30분간 로스팅), PL-25-1(칡 250℃, 10분간 로스팅), PL-25-2(칡 250℃, 20분간 로스팅), PL-25-3(칡 250℃, 30분 간 로스팅)로 각각의 실험 방법에 따라 전처리하여 사용하 였다.

Puerarin(Tokyo Chemical, Tokyo, Japan) 10 mg을 취하여 methanol(JT baker, Avantor Performance Materials, PA, USA)을 가해 100 mL로 정용하여 표준원액으로 하였다. 표준원액을 10 mL 용량플라스크에 methanol을 사용하여 50, 25, 10, 5 ppm의 표준용액을 제조하였다. 또한P. lobata 열수추출물 10종은 약 100 mg의 무게를 칭량 후, methanol 을 15 mL 넣어 30분간 ultrasonic cleaner(Powersonic 420, Hwashin Tech, Daegu, Korea)에서 초음파 추출한 다음 20분 간 방냉 후, 25 mL로 정용 후 4배 희석하여 0.45 μm membrane filter(ADVANTEC, Dublin, CA, USA)로 여과 후 시험용액으로 사용하였다.

상기 조제된 표준용액과 시험용액을 HPLC(Waters 2695, Milford, MA, USA), Photodiode Array Detector(Waters 996, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 고정상으로는 Shiseido C₁₈(5 μm 4.6×250 mm, Shiseido, Tokyo, Japan) 컬럼 을 사용하였고, 이동상은 methanol과 water가 25:75의 비율 로 유량 1.0 mL/min로 설정하여 254 nm파장에서 분석 하였 다. Puerarin의 검량선을 작성하고 시험용액에 함유된 함량 값을 계산하였다. 검량선의 회귀방정식은 y=0.000337x- 0.000152(R²=0.9998)로 고도의 유의적인 정의 상관관계가 있었다.

총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu's phenol reagent가 페놀성 화합물에 의해 몰리브덴 청색으로 환원되는 원리로 측정하 였다. 각 시료 1 mL에 2% Folin-Ciocalteu's phenol regent 1 mL을 첨가한 후 10% Na₂CO₃ 용액을 1 mL을 넣고 혼합하 여 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후 반응액의 흡광도 를 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 이용하였으며 표준 검량 곡선으로부터 총 페놀 함량을 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 시료를 각각 1 mg/mL의 농도로 제조한 뒤 증류수 1.25 mL를 가하고 5% NaNO2용액 75 μL를 넣고 5분간 방치한 후, 10% AlCl3·6H2O 용액 150 μL를 가하고 다시 6분간 방치하였다. 위 반응액에 1 M NaOH 500 μL와 증류수 275 μL를 가한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 Rutin(Sigma Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하여 표준검량선 을 작성 후 추출물의 총 플라보노이드 함량은 μg rutin equivalent(RE)/g으로 나타내었다.

7 mM ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate를 혼합 하여 빛을 차단한 상태로 16시간동안 상온에서 반응시켜 ABTS 양이온을 형성시킨 후 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도 록 무수에탄올을 이용하여 조절하였다. 시료 10 μL와 900 μL의 희석된 ABTS 용액을 첨가하고 6분 동안 반응시켜 microplate reader의 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.

$\text{ABTS\hspace{0.17em}라디칼 소거능 = 1-(}\frac{{\text{A}}_{\text{sample}}}{{\text{A}}_{\text{control}}}\text{)×100}$

농도별로 나눈 시료 200 μL와 0.4 mM DPPH 용액 800 μL을 첨가하고 10분 동안 반응시켜 microplate reader (Molecular Devices)의 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.

$\text{DPPH\hspace{0.17em}라디칼 소거능 = 1-(}\frac{{\text{A}}_{\text{sample}}}{{\text{A}}_{\text{control}}}\text{)×100}$

실험에서 얻어진 통계적 유의성은 SPSS(statistical package for social sciences, SPSS INC, ver.19.0, Chicago, IL, USA) package program을 이용하여 실험군 당 평균과 표준편차로 표시하였고, Duncan's multiple range test (p<0.05)에 의해 유의성을 검정하였다.

로스팅의 온도와 시간을 달리하여 로스팅한 칡 소재에 추출용매로 물을 사용하여 추출, 농축, 동결건조를 실시하 여 얻어진 수율(%)은 Table 1과 같다. Control의 수율은 23.55±0.45%로 나타났으며, 150℃에서 로스팅한 경우, 로 스팅 시간이 증가함에 따라 각각의 수율(26.26±0.39%, 26.38±0.39%, 27.36±0.45%)이 증가하였다. 200℃에서 로스 팅한 경우의 수율(28.01±0.11%, 28.61±0.31%, 28.75±0.33%) 과 250℃에서 로스팅한 경우의 수율(27.90±0.39%, 28.03± 0.50%, 28.94±0.31%)도 로스팅 시간이 증가함에 따라 각각 의 수율이 증가함을 알 수 있었다. 최적 수율을 보이는 로스 팅 조건은 200℃에서 20분, 30분 그리고, 250℃에서 30분으 로 나타났으며, 로스팅 하지 않은 control에 비해 로스팅한 시료들에서 모두 수율이 유의하게 증가함을 알 수 있었다.

Oh 등(6)이 칡뿌리 중의 항산화 성분에 대하여 분석한 자료에 의하면 플라보노이드 성분의 일종인 puerarin으로 확인 동정되었으며, 주요한 폴리페놀 물질이라고 보고하였 다. 또한 대한약전에서 칡의 지표물질로 puerarin으로 제시 되어 있다. 이에 본 연구는 로스팅을 통하여 칡 가공연구에 있어서 개발소재의 표준화를 위하여 지표성분으로 puerarin 으로 설정하였다.

칡의 지표성분인 puerarin 함량에 대해 로스팅 조건을 달리한 칡 추출물을 분석한 결과를 Table 1에 나타내었다. 로스팅 전의 칡 추출물(control)의 puerarin 함량은 72.19± 2.04 mg/g으로 나타났으며, 150℃에서 로스팅한 경우, 로스 팅 시간 10분, 20분, 30분 모두에서 대조군에 비해 puerarin 함량(83.25±0.54, 88.89±0.41, 88.18±0.21 mg/g)이 증가하였 다. 200℃에서 로스팅한 경우의 puerarin 함량(85.75±1.49, 91.83±0.22, 89.24±1.41 mg/g)과 250℃에서 로스팅한 경우 의 puerarin 함량(89.66±0.35, 91.42±2.16, 89.72±1.91 mg/g) 도 로스팅 시간 10분, 20분, 30분 모두에서 대조군에 비해 증가함을 알 수 있었다. Puerarin 함량이 가장 많은 로스팅 조건은 200℃에서 20분, 250℃에서 30분으로 나타났으며, 로스팅 하지 않은 control에 비해 로스팅한 시료들에서 모두 puerarin 함량이 유의하게 증가함을 알 수 있었다. Lee 등 (17)은 열풍건조 후 로스팅 처리한 씀바귀의 총 폴리페놀 함량이 증가함을 보고하였으며, Hong 등(18)은 로스팅 처 리한 치커리뿌리에서 페놀성 화합물의 함량이 증가한다고 보고하였다. 이와 같이 로스팅 처리한 칡에서 대표적인 폴 리페놀인 puerarin의 함량이 증가하는 것은 아마도 로스팅 공정에 따른 가열처리에 의해 칡의 내부 조직의 파괴로 인하여 페놀성 화합물이 쉽게 유리되어 함량이 증가하는 것으로 판단된다.

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 물질로 다양한 구조와 분자량을 가지며 페놀성 화합물의 phenol hydroxyl 기를 통해 항산화, 항암 및 항균 등의 생리기능을 가지는 것으로 알려져 있다(19). 로스팅 조건에 따라 처리한 칡 열수추출물의 총 페놀 함량 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 로스팅 처리에 따라 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 증가하는 경향을 나타내었는데, 이 는 Hong 등(18)과 Lee 등(20)의 연구 결과와 같은 경향을 보였다.

Control의 총 페놀 함량은 40.15±2.47 mg GAE/g으로 나 타났으며, 150℃에서 로스팅한 경우, 로스팅 시간이 증가함 에 따라 각각의 총 페놀 함량(40.24±0.53, 42.70±0.81, 42.78±0.30 mg GAE/g)이 증가하는 경향이 나타났다. 200℃ 에서 로스팅한 경우의 총 페놀 함량(40.54±0.07, 42.81± 0.43, 42.89±0.24 mg GAE/g)과 250℃에서 로스팅한 경우의 총 페놀 함량(42.92±0.27, 45.73±0.41, 45.99±0.48 mg GAE/g)도 로스팅 시간이 증가함에 따라 각각의 함량이 증 가함을 알 수 있었다.

Control의 총 플라보노이드 함량은 12.72±0.05 mg RE/g 으로 나타났으며, 150℃에서 로스팅한 경우, 로스팅 시간이 증가함에 따라 각각의 총 플라보노이드 함량(14.70±0.23, 16.94±0.33, 16.89±0.38 mg RE/g)이 증가하는 경향이 나타 났다. 200℃에서 로스팅한 경우의 총 플라보노이드 함량 (15.94±0.65, 17.31±0.09, 17.50±0.21 mg RE/g)과 250℃에서 로스팅한 경우의 총 플라보노이드 함량(16.49±0.25, 16.60± 0.13, 17.53±0.17 mg RE/g)도 로스팅 시간이 증가함에 따라 각각의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 총 페놀 함량이 가장 많은 로스팅 조건은 250℃에서 20분, 30분으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량이 가장 많은 로스팅 조건은 200℃에 서 20분, 30분 그리고, 250℃에서 30분으로 나타났으며, control에 비해 로스팅한 시료들에서 모두 총 페놀 및 플라 보노이드 함량이 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 이와 같은 함량 증가는 로스팅 온도가 높아짐에 따라, 로스팅 시간이 늘어남에 따라 두드러지게 나타났다. 이러한 결과 는 앞서 언급한 것과 마찬가지로 가열처리에 의해 칡의 내부 조직의 파괴로 인하여 추출시 페놀 화합물과 같은 성분들이 쉽게 유리되기 때문인 것으로 판단된다.

로스팅 처리 조건에 따라 추출한 칡 추출물의 항산화 효능을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 시료의 특성에 따라 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼과의 결합 정도가 다를 수 있어(21), 본 연구에서는 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 모두 분석하였다. ABTS 라디칼 소거능의 경우, control에서 66.04±0.10%로 나타났으며, 150℃에서 로스팅한 경우, 로 스팅 시간 10분, 20분, 30분 모두에서 대조군에 비해 ABTS 라디칼 소거능(73.36±0.18%, 75.95±0.40%, 80.00±0.45%) 이 증가하였다. 200℃에서 로스팅한 경우의 ABTS 라디칼 소거능(71.28±0.31%, 75.82±0.75%, 75.27± 1.69%)과 250℃ 에서 로스팅한 경우의 ABTS 라디칼 소거능(76.65±0.49%, 74.93±0.83%, 75.21±0.19%)도 로스팅 시간 10분, 20분, 30 분 모두에서 대조군에 비해 증가함을 알 수 있었다. 또한, DPPH 라디칼 소거능은 일반적으로 페놀성 화합물의 함량 과 연관성이 아주 높은 것으로 알려져 있다(18). DPPH 라디 칼 소거능의 경우, control에서 60.73±0.41%로 나타났으며, 150℃에서 로스팅한 경우, 로스팅 시간 10분, 20분, 30분 모두에서 대조군에 비해 DPPH 라디칼 소거능 (65.71±1.87%, 66.00±1.75%, 77.15±1.17%)이 증가하였다. 200℃에서 로스팅한 경우의 DPPH 라디칼 소거능 (78.92±0.80%, 78.18±1.76%, 81.45±0.50%)과 250℃에서 로 스팅한 경우의 DPPH 라디칼 소거능(77.97±0.33%, 77.77±2.35%, 77.62±0.34%)도 로스팅 시간 10분, 20분, 30 분 모두에서 대조군에 비해 증가함을 알 수 있었다. Kim 등(21)은 검정콩을 로스팅 처리 후 항산화 효과가 증가한다 고 보고하였으며 이는 본 연구의 결과와 유사함을 알수 있었다. 전체적으로 로스팅 처리한 칡의 항산화 활성이 가 장 높은 조건은 200℃에서 20분, 30분으로 나타났으며, 이 러한 결과는 앞서 언급한 총 페놀함량 및 플라보노이드 함량 측정 결과와 매우 유사함을 확인하였으며, 이는 대표 적인 항산화 성분인 폴리페놀 및 플라보노이드 등의 페놀성 화합물이 로스팅 처리에 의해 증가하여 항산화 효과가 증가 되었을 것으로 사료된다(22).