효소종류에 따른 불등풀가사리 유래 다당류의 이화학적 특성 및 생리활성

본 실험에 사용한 불등풀가사리는 전라남도 완도군에서 채취한 것을(유)제일물산에서 구입하여 본 실험에 사용하 였다. 구입한 불등풀가사리는 흐르는 물에 세척하고 50℃ 열풍 건조기(OF-22, JEIO TEC, Daejeon, Korea)로 건조한 다음 분쇄기(FM-909W, Hanil, Co., Sejong, Korea)로 분쇄한 후 60 mesh 이하의 분말로 제조하여 -20℃ 이하에 보관하면 서 효소분해용 시료로 사용하였다.

불등풀가사리 유래 다당류를 분리하기 위하여 건조된 분말 5 g에 증류수를 고형분 대비 50배 첨가한 다음 5종의 효소 flavourzyme(Flavourzyme 500 MG, 500 LAPU/g), papain(Collupulin MG, 5280 NF/mg) termamyl(Termamyl 120 L, 120 KNU/g), celluclast(Celluclast 1.5 L, 700 EGU/g) 및 viscozyme(Viscozyme L, 100 FBG/g)을 Novozymes Co. (Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하여 기질 대비 3% 첨가하 여 shaking incubator(BS-31, Jeio Tech., Daejeon, Korea)에서 150 rpm, 60℃, 14시간 교반 하였다. 교반한 시료는 원심분 리(3,000 ×g, 30분)한 다음 회수하여 상등액을 감압 농축기 (Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 60 °Brix가 될 때까지 농축하였다. 농축액은 5배량의 에탄올을 첨가하여 24시간 교반하고 원심분리 (3,000 ×g, 30분)하여 조다당류 를 회수하였고 동결건조(FreeZone 2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)하여 -70℃이하에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.

다당류 분리 수율은 동결건조기(Freezone 2.5, Labconco Co.)를 이용하여 건조한 후 분리된 다당류의 제조에 사용한 원료 건물량에 대한 고형분 함량으로 나타내었다.

총 당 함량 분석은 Saha와 Brewer(12)의 방법에 따라 페 놀-황산법으로 분석하였다. 즉 5% phenol 1 mL(w/v, Duksan Pure Chemicals, Seoul, Korea)와 sulfuric acid(Duksan Pure Chemicals) 5 mL를 시료 1 mL와 반응시킨 후 분광광도계 (Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 사 용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하고 glucose(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 표준곡선으로 이용하여 계산하였다.

총 단백질 함량은 Lowry 등(13)의 방법으로 측정하였으 며 bovine serum albumin(BSA, Sigma-Aldrich Co.)을 표준 곡선으로 이용하여 계산하였다.

Uronic acid 함량은 Cesaretti 등(14)의 방법에 따라 분석 하였다. 즉, 25 mM sodium tetraborate(Sigma-Aldrich Co.)를 진한 황산 용액으로 제조한 후 이 용액 0.2 mL와 시료 0.05 mL를 96-well plate에 넣고 잘 섞은 후 100℃에서 10분간 가열하였다. 그 다음 상온에서 15분 방냉한 후 0.125% carbazole(Sigma-Aldrich Co.) 0.05 mL를 가하고 100℃에서 10분간 가열 후 상온에서 15분 방냉하여 microplate reader(Asys UVM340, Biochrom, Eugendorf, Austria)로 550 nm에서 흡광도를 측정하고, galacturonic acid(Sigma- Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하였다.

황산기 함량분석은 Dodgson과 Price(15)의 방법으로 분 석하였다. 시료 3 mg에 6 N hydrochloric acid(HCl, Duksan Pure Chemicals.) 10 mL를 가한 후 110℃에서 6시간 가수분 해하였다. 가수분해한 시료 0.2 mL에 3% trichloroacetic acid(TCA, Acros organics, Geel, Belgium)를 3.8 mL 및 BaCl2-gelatin 용액 1 mL를 가하고 25℃에서 15분간 반응한 다음 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co.)를 사용 하여 360 nm에서 흡광도를 측정하였으며, potassium sulfate(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으 로부터 함량을 계산하였다.

DPPH radical 소거활성 측정은1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich Co.)의 환원력을 이용하여 측정하였 다(16). 5 mg/mL 농도로 희석한 시료 1 mL에 4×10^-4 M DPPH 용액(99.9% ethyl alcohol에 용해) 1 mL를 가하여 총액의 부피가 2 mL가 되도록 하였다. 이 반응액을 약 10초 간 혼합하고 실온에서 30분 방치한 다음 525 nm에서 분광 광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co.)를 사용하여 측정 하였으며, DPPH radical 소거활성은 시료의 첨가 전과 후의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

$\text{DPPH Radical scavenging activity(\%)=(1-}\frac{\text{sample absorbance}}{\text{control absorbance}}\text{)×100}$

Ferric reducing antioxidant potential(FRAP)법에 의한 환 원력은 Benzie와 Strain(17)의 방법에 따라 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine, Sigma-Aldrich Co.) 용액 및 20 mM FeCl₃·6H₂O(Sigma-Aldrich Co.)를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37℃의 수욕상에서 가온한 것을 FRAP 기질 용액으로 사용하였다. 96-well plate에 5 mg/mL 농도로 희석한 시료액 25 μL와 FRAP 기질액 175 μL를 차례대로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응 시킨 후 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.)를 사용하여 590 nm에서 흡광 도를 측정하였다.

실험에 이용한 세포주는 폐 정상세포(L132), 마우스 대식 세포(RAW264.7), 인간 폐암세포(A549), 인간 위암세포 (SNU719), 인간 자궁경부암세포(HeLa) 및 인간 유방암세 포(MCF7)를 한국 세포주 은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. L132, A549, SNU719, HeLa 및 MCF7 세포주는 RPMI 1640(Welgene, Daegu, Korea) 배지 를 사용하였고 RAW264.7 세포주는 DMEM(Welgene) 배지 를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum, 1% penicillinstreptomycin( Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 사용하였다. 세포는 모두 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-18AIC, SANYO Co., Sakata, Japan)에 적응시켜 각각 배양시켰다.

L132 및 RAW264.7 세포에 대한 독성은 MTT assay로 측정하였으며, 배양된 세포주를 5×10⁴ cell/well의 농도로 조정하여 96-well plate에 100 μL씩 첨가하여 24시간 배양하 고, 이후 새로운 배지에 시료를 농도별로 처리한 다음 24시 간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 녹인 methyl thiazol-2-YL-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT 5 mg/mL, Sigma-Aldrich Co.)용액을 각 well에 10 μL씩 첨가 하고 다시 4시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 이후 상등액을 완전히 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO, Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan) 100 μL를 각 well에 첨가 하여 10분간 반응시켜 formazan 결정을 완전히 용해한 다음 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

L132 세포에 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 손상에 대한 세포보호 효과를 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였으 며, L132 세포를 96-well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주하 고 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 시료를 처리하고 24시간 동안 배양한 다음 H₂O₂(Duksan Pure Chemicals.)를 1 mM의 농도로 첨가하고 30분간 처리 후 L132 세포에 MTT(5 mg/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하 여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 상등액을 제거하고 각 well에 200 μL의 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가한 다음 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고 세포보호 효과는 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

RAW264.7 세포를 5×10⁴ cell/well가 되도록 96-well plate 에 각각 100 μL씩 첨가하여 24시간 배양하고, 시료 및 lipopolysaccharides(LPS 0.1 μg/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 상등액 50 μL에 동량의 griess(Sigma-Aldrich Co.)시약을 혼합하여 10 분간 반응 시킨 후 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며 nitric oxide 생성량은 sodium nitrite(Sigma-Aldrich Co.)의 농도별 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

배양된 4종의 암세포주 A549, SNU719, HeLa 및 MCF7을 2×10⁴ cell/mL로 96 well plate에 각각 100 μL씩 첨가하여 incubator에서 24시간 배양하고 시료를 각각 처리한 후 48시 간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 녹인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT 5 mg/mL, Sigma-Aldrich Co.) 용액을 각 well 에 10 μL씩 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 배양종료 후 생성된 formazan 결정이 흐트러지지 않게 배양액을 완전히 제거하고 제거된 각 well 에 100 μL씩의 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 가하여 10분간 반응시켜 formazan 결정을 용해한 후 microplate reader (UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 doxorubicin(DOX, Sigma- Aldrich Co.)을 1 μg/mL농도로 사용하여 비교하였다.

실험결과는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었 고 SPSS(19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의 성(p<0.05)은 Duncan’s multiple range test로 검정하였다.

효소종류에 따른 불등풀가사리 유래 다당류의 수율, 총 당 함량, 단백질, uronic acid 및 sulfate 함량은 Table 1과 같다. 효소종류(celluclast, flavourzyme, papain, termamyl, viscozyme)에 따른 불등풀가사리 다당의 수율은 효소 분해 구간에서 52.8-66.4%를 나타내어 무처리 구간 50.6%에 비 해 유의적으로 높은 수율을 나타내었으며, viscozyme 효소 분해 구간에서 가장 높은 수율을 나타내었다. 이는 Lee 등 (18)의 효소처리에 의한 참당귀 다당 분리 연구에서 viscozyme L 효소 처리구간에서 가장 높은 수율을 나타낸 다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다.

총 당 및 총 단백질 함량은 viscozyme 효소 분해 구간에서 각각 71.04% 및 7.22%로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 무처리 구간에서 각각 61.54% 및 5.39%로 가장 낮은 함량 을 나타내었다. Uronic acid 및 sulfate 함량의 경우에도 viscozyme 효소 분해 구간에서 각각 23.18 g/100 및 28.27% 의 함량을 나타내어 무처리 구간 18.25 g/100 및 22.00% 보다 높은 함량을 나타내었다. 이러한 결과는 viscozyme 효소에 포함되어 있는 다양한 복합효소(arabanase, cellulase, β-glucanase, hemi-cellulase, xylanase) 분해 작용에 의해 식 물 세포벽에 있는 성분을 분해하여 섬유질이나 당단백질 또는 고분자 물질 등의 활성물질들이 원활하게 추출될 수 있도록 유도하여 높은 수율과 생리활성을 나타낸 것으로 사료된다(19). 또한, Papain(단백질 중간부분에서 무작위로 분해하는 endoprotease) 및 flavourzyme(단백질 말단에서 아 미노산 단위로 분해하는 exoprotease)의 경우 단백질분해효 소 중 비교적 높은 가수분해효과를 나타내는 것으로 알려져 있으나(18), 불등풀가사리 다당류 추출을 위한 효소로는 효과적이지 않았으며 viscozyme 효소 분해를 통한 uronic acid 및 sulfate 함량 증가는 면역 및 항보체 활성과 항암 및 항혈전 효능 등의 생리활성을 나타낼 것으로 사료된다 (20,21).

불등풀가사리 유래 다당류의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH radical 소거활성 및 ferric reducing antioxidant potential(FRAP)를 5 mg/mL 농도에서 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 효소 분해 구간의 DPPH radical 소거활성 및 FRAP는 각각 14.97-23.10% 및 123.06-218.50 μM를 나타내 어 무처리 구간 10.55% 및 102.44 μM에 비해 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, viscozyme 효소 구간에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이는 다당류에 함유되어 있는 sulfate 함량이 항산화 활성을 나타내는 중요한 척도로 알려 져 있으며(22), Yang 등(23)의 홍조식물(참산호말)에서 추 출한 황산다당류의 항산화활성 연구에서 sulfate 함량이 높 은 구간에서 우수한 항산화 활성을 나타낸다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다. 또한, uronic acid 와 다당류간의 상호관계를 통해 항산화 활성 증진에 영향을 미친다고 알려져 있으나, 이러한 다당류의 항산화 활성은 하나의 단일 인자에 올리고머 중합체, sulfate 함량 및 당과 단백질 구성요소 작용에 의해 달라진다고 보고하였다(24). 따라서, 불등풀가사리에서 분리된 다당류에 함유되어 있는 uronic acid 및 sulfate 함량 증가와 다양한 구성 요소에 의해 항산화 활성이 증진된 것으로 사료된다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity and fer ric reducing antioxidant potential of polysacchar ides from Gloiopeltis furcata. (A), DPPH radical scavenging activity; (B), ferric reducing antioxidant potential. Control, polysaccharide isolated from non-enzyme treatment; Celluclast, polysaccharide isolated from celluclast enzyme treatment; Flavourzyme, polysaccharide isolated from flavourzyme enzyme treatment; Papain, polysaccharide isolated from papain enzyme treatment; Termamyl, polysaccharide isolated from termamyl enzyme treatment; Viscozyme, polysaccharide isolated from viscozyme enzyme treatment. Means with different letters above the bars are significantly different at p<0.05.

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효소 종류에 따른 불등풀가사리 유래 다당류를 폐 정상 세포(L132)에 농도별로 처리하여 MTT 분석 방법으로 세포 독성을 측정한 결과(Fig 2), 다당류 0.1-1 μg/mL 농도까지 유의적인 세포 사멸이 나타나지 않아 세포 독성이 없음을 확인하여 세포 보호 효과 실험 농도로 설정하였다.

Fig. 2. Effect of polysaccharides from Gloiopeltis furcata on the cell viability of L-132 cell. (A), cytotoxicity; (B), Protective effect against H₂O₂-induced cytotoxicity. Control, polysaccharide isolated from non-enzyme treatment; Celluclast, polysaccharide isolated from celluclast enzyme treatment; Flavourzyme, polysaccharide isolated from flavourzyme enzyme treatment; Papain, polysaccharide isolated from papain enzyme treatment; Termamyl, polysaccharide isolated from termamyl enzyme treatment; Viscozyme, polysaccharide isolated from viscozyme enzyme treatment. Means with different letters above the bars are significantly different at p<0.05.

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불등풀가사리에서 분리된 다당의 산화적 손상에 대한 세포 보호효과를 알아보기 위하여, H₂O₂ 처리를 통한 L132 세포에 산화적 손상을 유발 하였을 때 세포 생존율을 측정 하였다(Fig 2). 세포 보호 효과 실험에 사용되는 H₂O₂는 쉽게 원형질막을 통과하기 때문에in vitro 또는in vivo 실험 의 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 산화적 손상을 유발하는 독성 물질로 많이 이용되고 있다(25).

이러한 산화적 손상에 대한 불등풀가사리 유래 다당의 세포 보호 효과는 1 μg/mL 농도에서 효소처리에 의해 분리 된 다당류의 경우 71.89-85.64%의 보호 효과를 나타내어 무처리 구간 61.30%에 비해 높은 세포 보호 효과를 나타내 었으며, Cho 등(26)은 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 스트레스 에 대한 블랙베리의 세포보호효과 연구에서 세포 보호효과 는 항산화활성과 유사한 경향을 나타내는 것으로 보고하였 다. 따라서 불등풀가사리 유래 다당이 H₂O₂ 처리로 인해 발생하는 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 세포생존율 을 증가시키는 것으로 판단된다.

효소 종류에 따른 불등풀가사리 유래 다당류를 대식세포 (RAW264.7) 세포에 농도별로 처리하여 MTT 분석 방법으 로 세포 독성을 측정한 결과(data not shown), 다당류 0.1-5 μg/mL 농도까지 유의적인 세포 사멸이 나타나지 않아 세포 독성이 없음을 확인하여 면역증강 세포실험의 농도로 설정 하였다.

대식세포는 아주 오래전부터 숙주방어 및 선천 면역반응 에 중요한 역할을 하고 있으며, 대식세포의 활성화는 병원 균 감염에 대한 자기방어 방법 중 하나로 알려져 있다(27). NO 생성량은 효소 분해를 통해 분리된 다당에서 15.67-20.93 μM을 나타내어 무처리 다당 14.63 μM에 비해 높은 생성량을 나타내었다(Fig. 3). 가장 높은 NO 생성량을 나타낸 viscozyme 효소 분해 구간의 경우 0.1-5 μg/mL 농도 에서 NO 생성량(20.93-32.13 μM)이 농도 유의적으로 증가 함을 확인하였으며 5 μg/mL 농도에서 양성대조군으로 사 용한 LPS(0.1 μg/mL)의 약 90% 생성량을 나타내어 불등풀 가사리 유래 다당의 우수함을 확인하였다. 일반적으로 해 조류 유래 황함 다당류는 항암 및 면역증진 효능이 우수한 것으로 알려져 있으며(28), Leiro 등(29)의 해조류(Ulva rigida) 유래 황산다당류의 면역 활성 연구에서 NO 생성량 은 황산기 함량과 비례한다고 보고하였으며, 또한, Lee 등 (30)의 우렁쉥이 껍질 다당 추출물의 면역증강 연구에서 대식세포에 시료를 처리한 결과 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 증가하였다는 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서, 불등풀가사리 유래 다당류는 높은 NO 생성량을 통해 면역 세포를 활성화시켜 싸이토카인 분비촉진, 대 식세포 및 보체시스템의 활성화 등에 관여할 것으로 사 료된다.

Fig. 3. Nitr ic oxide production of polysaccharides from Gloiopeltis furcata. (A), enzymes; (B), viscozymes. Control, polysaccharide isolated from non-enzyme treatment; Celluclast, polysaccharide isolated from celluclast enzyme treatment; Flavourzyme, polysaccharide isolated from flavourzyme enzyme treatment; Papain, polysaccharide isolated from papain enzyme treatment; Termamyl, polysaccharide isolated from termamyl enzyme treatment; Viscozyme, polysaccharide isolated from viscozyme enzyme treatment. Means with different letters above the bars are significantly different at p<0.05.

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4종의 암세포주 인간 폐암세포(A549), 인간 위암세포 (SNU719), 인간 자궁경부암세포(HeLa) 및 인간 유방암세 포(MCF7)에 대한 불등풀가사리 유래 다당류의 암세포 저 해율은 Fig. 4와 같다. 4종의 암세포주에 시료를 5-25 μg/mL 농도로 가한 후 48시간 배양한 결과 5 μg/mL 이상의 농도에 서 유의적인 암세포 생존 저해율을 확인 할 수 있었으며 농도가 증가함에 따라 유의적으로 생존 저해 효과를 나타내 었다. Viscozyme 효소 분해를 통해 분리된 다당 25 μg/mL 농도에서 A549, SNU719, HeLa 및 MCF7 암세포주 저해 효과는 각각 69.57%, 61.06%, 52.74% 및 68.64%를 나타내 었으며, 무처리 구간의 경우 78.89%, 83.19%, 71.05% 및 82.65%를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 효소 분해를 통해 분리된 다당의 경우 농도 의존적으로 낮은 암세포 성장률을 나타내었으며, 그 중 viscozyme 효소 처리 구간에 서 다른 구간에 비해 낮은 암세포 생존율을 확인하여 암세 포 성장 억제효과가 높게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 암은 세포의 증식이 비정상적으로 증가되거나 adopotosis 가 적절하게 이루어지지 않고 감소하는 경우에 발생되는 데, 인체의 면역조절 작용에서 대식세포는 암세포를 억제 하는 항암효과를 나타내며 NO, cytokine 등이 중요한 역할 을 하는 것으로 알려져 있다(31). 또한, Park 등(7)의 불등풀 가사리 분획물의 암세포 성장 억제효과 연구에서 여성암인 유방암과 자궁경부암에 효과가 탁월하다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었으며, NO 생성량 증가 를 통해 대식세포의 탐식능을 증가시키고 항암활성을 증가 시킨 것으로 사료된다.

Fig. 4. Antitumor activity of polysacchar ides from Gloiopeltis furcata. (A), A549; (B), SNU719; (C), HeLa; (D), MCF7. Control, polysaccharide isolated from non-enzyme treatment; Celluclast, polysaccharide isolated from celluclast enzyme treatment; Flavourzyme, polysaccharide isolated from flavourzyme enzyme treatment; Papain, polysaccharide isolated from papain enzyme treatment; Termamyl, polysaccharide isolated from termamyl enzyme treatment; Viscozyme, polysaccharide isolated from viscozyme enzyme treatment. Means with different letters above the bars are significantly different at p<0.05.

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