장기간의 지구성 운동과 단삼식초 섭취가 고지방식 유도 비만 흰 쥐의 신체구성과 인슐린 저항성에 미치는 영향

10주령 수컷 Wistar 흰쥐(weight, 300-330 g) 40마리를 대상으로 1주간의 환경적응기간을 거친 후 8주간 고지방식 처치로 비만을 유도하였다. 이후 4 집단, 즉 좌업군(sedentary group; Sed, n=10), 운동군(exercise group; Ex, n=10), 단삼식 초섭취군(Salvia miltiorrhiza vinegar group; SV, n=10), 운동 군+단삼식초섭취 복합처치군(EV, n=10) 등으로 무선, 배정 하여 총 8주간 운동 및 식이처치를 실시하였다. 흰쥐는 한 케이지(20.7×35×17 cm)에 2 마리씩 사육하였으며, 사육실 의 온도는 21℃로 유지하였다. 명기와 암기를 각각 12 시간 으로 조절하였으며, 암기는 오전 7:00시에서 오후 7:00로 조절하였다. 실험기간 동안 체중과 사료섭취량은 매일 측 정하였다. 본 동물실험계획서는 (재)대구테크노파크 바이 오헬스융합센터 동물실험윤리위원회의 심의를 통과하였 다(승인번호: BHCC-IACUC-2015-09).

고지방식이는 총 열량에 대해서 carbohydrate 30%, fat 50%, protein 20%가 되도록 하였으며, 세부내용은 1,000 g/kg기준 casein 245.0 g, sucrose 200.0 g, corn starch 85.0 g, cellulose 58.0 g, choline bitariate 3.0 g, L-cystine 3.5 g, maltodextrin 115.0 g, lard 195.0 g, soybean oil 30.0 g, vitamins(19 g/kg AIN-93G-VX no. 94047), minerals(43 g/kg AIN-93G-MK mix no. 94046), calcium phosphate 3.4 g, Red food color 0.1 g 등을 혼합하여 사용하였다(22). 식수와 사료 의 섭취는 자유롭게 하였다.

단삼식초섭취군은 Lee 등(23)의 방법을 일부 수정하여 단삼식초(산도 4.2±0.01%, 알코올 함량 0.2±0.01%, pH 3.4±0.00, 당도 4.7±0.01 °Brix, ㈜케이엠에프 제공)를 1일 7 mL/kg 경구 투여 하였다. 나머지 집단은 경구 투여에 대한 스트레스를 동일하게 주기 위해서 동일한 양의 생리식 염수를 경구 투여 하였다. 운동 프로토콜은 Ivy 등(24)의 방법을 부분적으로 수정하여 적용하였다. 전동식 실험동물 용 트레드밀(Quinton Instrument, Seattle, WA, USA)을 이용 하여 중강도로 주 3회 트레드밀 달리기를 실시하였다. 초기 1주간 운동 프로그램의 적응을 위해 10 m/min의 속도와 경사도 0°로 5분간 실시한 후 점증적으로 트레드밀 속도와 경사도, 시간을 증가시켜 2주부터는 경사도 8°에서 20 m/min의 속도로 30분간 달릴 수 있도록 하여 실험 종료 시까지 운동 수준을 유지하였다. 모든 처치는 오전 9:00-10:00 사이에 실시하였으며, 운동과 단삼식초섭취의 혼합 처치 시에는 운동 60분 전 단삼식초를 섭취시킨 다음 운동을 실시하였다.

지구성 운동과 단삼식초가 비만 흰쥐의 혈당조절 효과에 미치는 영향을 검증하기 위해서 경구당 부하검사를 실시하 였다. 8주간의 처치 후 last-bout exercise effect를 배제하기 위해 48시간 휴식하고, 12시간 금식시켰다. 꼬리를 통해서 안정 시 혈액을 채취한 후 50% 포도당 용액을 1 g/kg으로 경구 투여 하였다. 이후 15, 30, 60분에 꼬리로 부터 300 μL의 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 항 응고 처리(5 μL 헤파린)한 후 원심 분리하여(1,500 ×g, 15분) 혈장만을 추출한 다음 분석 전 까지 -80℃에서 보관하였다. 혈액 채취 가 끝난 흰쥐들은 소실된 혈장을 보충시키기 위해서 0.9% 생리식염수 용액(2.5 mL)을 피하에 주입하였다.

총 8주간의 처치 후 12시간 금식을 실시하고 pentobarbital sodium(5 mg/100 g of body mass)으로 마취하여 소 동물용 DEXA(DSC-3000, Aloka, Tokyo, Japan)를 이용하여 신체구 성을 측정하였다. 이 후 복강을 열어 복부동맥에서 혈액 5 mL을 채취하고, 12시간 냉장 보관하여 serum을 분리한 후 분석 전 까지 -20℃에서 보관하였다. 혈액 채취 후 부위 별 체지방(epididymal, mesenteric, retroperitoneal fat pad)을 적출하고 무게를 측정하였다.

혈당과 혈중 인슐린 수준은 꼬리에서 수집된 혈액을 항 응고 처리하여 얻은 혈장을 이용하여 분석하였다. 혈당은 자동혈당측정기(YSI 2300 STAT plus, YSI, USA)로 측정하 였으며, 혈중 인슐린 농도는 ELISA Kit(Diagnostic Products Corporation, California, LA, USA)를 이용하여 분석하였다. 복강에서 채취한 혈액은 혈청을 분리하여 Sigma사의 ELISA kit(kits 352, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 효소분 석법으로 총콜레스테롤(total cholesterol, TC) 수준을 분석 하였다.

모든 자료는 SigmaPlot 12.0 통계프로그램을 이용하여 각 그룹별 평균과 표준오차(Mean±SE)를 산출하였다. 측정 변인들에 대한 그룹 간 차이를 분석하기 위하여 One-way ANOVA를 실시하였으며, 경구당 부하검사 결과는 처치와 시간에 따른 유의차를 분석하기 위해서 Two-way repeated ANOVA를 실시하였다. 사후검정은 Tukey 방법을 이용하 였으며, 통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

8주간의 지구성 운동군 또는 단삼식초섭취군은 고지방 식 유도 비만 흰쥐의 체중에 유의한 영향을 미치지 않았다. 그러나 지구성 운동과 단삼식초섭취의 복합처치군의 체중 은 다른 3 집단에 비해서 유의하게 감소하였다(p<0.05). 체지방과 제지방량은 지구성 운동군과 좌업군 간에 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 단삼식초섭취군은 다른 3집단 에 비해서 체지방량이 유의하게 증가하였으며, 제지방량은 유의하게 감소한 것으로 나타났다(p<0.05). 그러나 지구성 운동과 단삼식초섭취의 복합처치군의 체지방과 제지방량 은 좌업군과 운동군과 비교해서 유의한 차이가 나타나지 않았다(Fig. 1). 신체분포 부위에 따른 체지방량을 측정한 결과, 8주간의 지구성 운동군은 epididymal, mesentric fat pad 양이 유의하게감소하였다(p<0.05). 그러나 retroperitoneal fat pad에서는 지구성 운동의 효과가 나타나지 않았다. 이 와는 다르게 단삼식초섭취군은 다른 3집단에 비해 retroperitoneal fat pad 양이 유의하게 증가한 것으로 나타났 다(p<0.05, Fig. 2). 본 연구의 결과와 유사하게 Chapados 등(25)은 고지방식이(총열량의 42%) 유도 비만 흰쥐를 대 상으로 중강도의 지구성 운동트레이닝이 내장지방 저장소 (mesenteric)와 비 내장지방 저장소(retroperitoneal)의 지방 분해에 미치는 영향을 분석한 결과, 운동트레이닝은 mesenteric fat pad의 지방 분해는 자극하는데 반해서 retroperitoneal fat pad의 지방분해에는 영향을 미치지 않는 것으로 보고하였다. 따라서 지구성 운동 시 내장지방의 현 저한 감소현상을 뒷받침할 수 있는 것으로 간주되며, 내장 지방은 비 내장지방 조직보다 고지혈증, 인슐린 저항성 및 2형 당뇨병과 같은 대사기능 이상에 현저한 영향을 미치는 것으로 보고되어 왔다(26).

Fig. 1. Compar ison of body composition. Sed, sedentary group; Ex, exercise group; SV, Salvia miltiorrhiza vinegar group; EV, exercise+salvia miltiorrhiza vinegar group. Significantly different from Sed, Ex, SV (p<0.05). #, Significantly different from Sed, Ex, EV (p<0.05). +, Significantly different from Sed, Ex (p<0.05).

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Fig. 2. Compar ison of fat pad weight in body par t. Sed, sedentary group; Ex, exercise group; SV, Salvia miltiorrhiza vinegar group; EV, exercise+Salvia miltiorrhiza vinegar group. *, Significantly different from Sed, Ex, Ev (p<0.05). +, Significantly different from Sed, SV (p<0.05).

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식이섭취량이 8주간의 처치동안 집단 간 1일 식이섭취열 량의 차이는 나타나지 않았다. 운동군의 1일 식이섭취열량 이 복합처치군에 비해 높은 경향을 나타냈으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Fig. 3). 식초는 수세기 동안 식품 방부제 및 다양한 질병에 대한 약제로 사용되어 왔으며, 식초의 항비만, 항고혈당 효과는 인간과 동물을 대상으로 실시된 다수의 연구를 통하여 제시되어 왔는데(27-29), 식 초의 전분소화력 간섭(30) 또는 위 배출 지연(27,29), 말초의 글루코스 흡수 및 글리코겐으로의 전환 및 포만감 증가(31) 등이 제시되었다. 그러나 본 연구에서 단삼식초섭취군의 1일 식이섭취량이 다른 집단과 유사하게 나타남으로서 단 삼식초섭취에 의한 식욕 조절 가능성은 보다 계속적인 연구 가 요구되었다.

Fig. 3. Compar ison of food consumption per day. Sed, sedentary group; Ex, exercise group; SV, Salvia miltiorrhiza vinegar group; EV, exercise+Salvia miltiorrhiza vinegar group.

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전신의 인슐린 감수성을 검증하기 위해서 경구당 부하검 사를 실시한 결과 8주간의 지구성 운동군의 혈당 및 인슐린 반응이 좌업군에 비해서 유의하게 개선된 것으로 나타났으 며(p<0.05), 복합처치군도 혈당 및 인슐린 반응이 유의하게 개선된 것으로 나타났다. 그러나 단삼식초섭취군은 혈당 및 인슐린 반응의 유의한 변화를 나타내지 않았다(Fig 4a, 4b). 즉 내장지방의 감소를 나타낸 지구성 운동군의 인슐린 저항성이 유의하게 감소하였으나, 내장지방의 변화가 나타 나지 않은 단삼식초섭취군은 인슐린 저항성의 현저한 개선 이 나타나지 않았다. 지구성 운동군 혹은 지구성 운동과 단삼식초섭취의 복합처치군에서 인슐린 저항성이 개선된 것은 지구성 운동과 단삼식초섭취의 긍정적인 결과로 간주 될 수 있으나 단삼식초섭취 만에 의한 개선된 결과가 나타 나지 않음으로서 단삼식초의 섭취효과는 분명하게 확인되 지 못했다.

Fig. 4a. Compar ison of plasma glucose response to oral glucose tolerance test. Sed, sedentary group; Ex, exercise group; SV, Salvia miltiorrhiza vinegar group; EV, exercise+Salvia miltiorrhiza vinegar group. +, Significantly different from Sed, Ex group (p<0.05).

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Fig. 4b. Compar ison of plasma insulin concentration in OGTT. Sed, sedentary group; Ex, exercise group; SV, Salvia miltiorrhiza vinegar group; EV, exercise+salvia miltiorrhiza vinegar group. +, Significantly different from Sed, SV grop (p<0.05).

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8주간의 지구성 운동군은 좌업군에 비해서 혈청 콜레스 테롤 농도가 유의한 감소를 나타냈다(p<0.05). 그러나 단삼 식초섭취군의 혈청 총콜레스테롤 농도는 좌업군과 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 지구성 운동과 단삼식초섭취의 복합처치군도 유의한 차이를 나타내지 않았다(Fig. 5). 이러 한 결과는 지구성 운동이 혈중 지질농도에 미치는 긍정적인 효과가 단삼식초섭취의 복합처치로 인해서 상쇄된 것으로 도 해석될 수 있으나, 이와 관련된 보다 세부적인 원인에 대한 규명이 요구된다. 특히 단삼식초 섭취군의 신체구성 이 다른 집단과는 상반되게 나타났다는 것은 항 비만과 관련된 효과도 확인할 수 없음을 의미한다.

Fig. 5. Compar ison of total plasma cholesterol concentration. Sed, sedentary group; Ex, exercise group; SV, Salvia miltiorrhiza vinegar group; EV, exercise+Salvia miltiorrhiza vinegar group. *, Significantly different from Sed, SV, EV groups (p<0.05).

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단삼이 대사성 증후군에 미치는 영향에 대한 대부분의 연구결과들은 비교적 긍정적인 결과들을 제시하고 있는데 반해서 본 연구에서는 대사성 증후군의 처치 가능성과 관련 된 기대했던 결과를 확인할 수 없었다. 그러나 본 연구에서 는 현상학적 접근만을 분석한 것으로서 그 세부적인 원인을 규명할 수 있는 분자생물학적 접근은 시도하지 않았기 때문 에 분명한 결론에 이르기는 어려운 것으로 생각된다. 최근 단삼이 AMPK 신호전달체계를 활성화 시키고, 성장호르몬 의 분비를 저해시킴으로서 항고혈당효과를 나타내며(32), Glut-1, GK 및 Glut-4와 같은 간 글리코겐 합성 유전자를 증가시키고 SREBP-1c, ACC, ATP-CL, ACS와 같은 지방 및 콜레스테롤 동화 작용 유전자를 감소시키는 것으로 보고 되었다(33). 이러한 근거를 바탕으로 추가적 분석 및 후속 연구를 실시하여 단삼의 항비만, 항고혈당 기전을 명확하 게 규명할 필요성이 있다.