Aspergillus oryzae와 단백질 분해효소 첨가에 따른 콩알메주 된장의 이화학적 특성 변화

콩알 메주 및 증자콩은 대원콩을 이용하였으며, 콩알메 주에 사용한 균주는 메주에서 분리된 Aspergillus oryzae SCF-6로 순창장류연구소에서 제공받았다. 사용효소는 단 백질 분해효소(protease)로 우리나라 장류식품에서 주로 분 리되고 특히 된장 발효에 관여하는Baciillus속과Aspergillus 속 중 시판되고 있는 Bacillus licheniformis에서 유래된 Alkaline protease(최적 pH 7-9)와Aspergillus속에서 유래한 Promod 279(최적 pH 4-6)를 (주)비전바이오켐에서 구입하 여 이용하였다.

콩알메주는 대두 품종 중 대표적인 대원콩을 이용하여 제조하였으며 Lee(15)의 방법을 변형하여 실시하였다. 먼 저 콩을 2배 이상의 물로 15시간 침지한 후 121℃에서 60분 동안 증자하였다. 증자 된 콩을 40℃ 이하의 온도로 식힌 후A. oryzae를 접종하여 30℃, 80% RH에서 40시간 발효시 켰다. 이때A. oryzae 배양액은 1×10⁷ spore/mL 농도가 되도 록 배양하여 대두 무게의 1%(v/w)가 되도록 첨가하였다.

Lee 등(9)의 방법에 따라 된장 제조를 수행하였으며, 제 조된 콩알메주에 증자콩, 소금, 물을 혼합하여 소금농도 13%로 조정하였다. 이렇게 제조한 된장에 단백질 분해효소 를 Alkaline protease(Protease A, 1%), Promod 279(Protease B, 1%), Alkaline protease(A, 0.5%)+Promod 279(B, 0.5%)를 첨가, 혼합하여 3시간 후에 0주차 시료를 채취하였고, 8주 동안 30℃에서 발효시켜 시료로 사용하였다.

콩알메주 된장의 시료액은 시료 8 g을 증류수로 5배 희석 하고 homogenizer(Polytron PT-MR 2100, Kinematica AG, Lucerne, Switzerland)로 1분간 조직을 파괴한 후 8,000 rpm 에서 10분간 원심분리(Supra 25k, Hanil Co., Ltd., Incheon, Korea)하여 상층액을 취해 시료액으로 사용하였다.

콩알메주 된장의 수분 함량은 AOAC 법(16)에 따라 10 5℃ 상압건조법에 의해 분석하였다. 즉, 시료 2 g을 105℃ drying oven(MOV-112, Sanyo Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 항량이 될 때까지 건조시켜 백분율(%)로 나타내었다.

염도는 Mohr 법(17)에 따라 시료액 10 mL에 지시약인 5% K₂CrO₄를 첨가하고 0.1 N AgNO₃ 용액으로 미적갈색이 될 때까지 적정하여 염소량을 측정 한 후 NaCl량으로 환산 하였다.

콩알메주 된장의 pH는 시료액에 pH meter(Orion star a211, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하였고 적정산도는 Jin(18) 등의 방법에 따라 시료액 10 mL에 0.5% 페놀프탈레인 지시약을 넣고 0.1 N NaOH로 미적색이 될 때까지 적정하여 그 함량을 계산하였다.

콩알메주 된장의 환원당은 dinitrosalicylic acid(DNS) 방 법(19)에 따라 시료액 1 mL에 DNS용액 3 mL을 혼합한 후끓는물에5분간중탕하여실온으로냉각시켰다. microplate reader(Biotek Synergy Mx, Biotek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 550 nm의 파장으로 흡광도를 측정하 여 표준물질로 glucose를 사용하여 검량선을 그려 상대적인 함량을 계산하였다. 아미노태 질소는 시료액 5 mL에 중성 formalin 용액 10 mL과 증류수 10 mL을 넣은 본 시험과 시료액 5 mL에 증류수 20 mL을 넣은 공시험에 0.5% 페놀프 탈레인 지시약을 넣고 0.1 N NaOH를 이용하여 pH 8.4(미적 색)가 되도록 중화 적정하여 아미노태 질소 함량(%)을 산출 하였다.

된장의 색도는 Ultrascan Pro(Pro Hunter Lab, Reston, VA, USA)를 사용하여 측정 후 Hunter scale의 L(lightness), a(redness), b(yellowness) 값으로 나타내었다(20). 이때 사용 한 표준 백색판(standardplate)의 색도는 L(99.52), a(-0.12), b(-0.16)이었다.

α-amylase 활성은 1% 전분 기질액 1 mL을 40℃에서 5분 동안 예온하고 시료액 50 μL를 넣어 반응시킨 반응액 50 μL와 요오드용액 5 mL를 혼합한 용액과 30℃에서 30분간 반응 시킨 후 반응액과 요오드용액의 660 nm의 파장으로 흡광도 측정한 값의 차를 이용하여 산출하였다(21).

protease 활성은 0.6% casein 기질용액 1 mL과 시료액 1 mL을 37℃에서 10분간 반응시킨 반응액에 0.4 M trichloroacetic acid(TCA) 2 mL를 넣고 37℃에서 25분간 반 응을 정지시킨 본 실험과 시료액 1 mL을 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4 M TCA 2 mL과 0.6% casein 기질용액 1 mL을 넣은 공시험구를 원심분리(8,000 rpm, 5분)하였다. 상등액 1 mL과 0.4 M Na₂CO₃ 5 mL과 Folin 시약(1:3) 1 mL을 넣어 37℃에서 20분간 반응하여 발색시킨 후 660 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였고 표준곡선은 tyrosine 를 이용하여 산출하였다(22).

된장 중 유리아미노산 조성 분석을 위해 시료 5 g을 취하 여 70% 에탄올 100 mL을 가하고 30분 동안 진탕 추출한 후, 원심분리(8,000 rpm, 10 min)하였다. 잔사에 70% 에탄올 50 mL로 2회 반복 추출하고, 합한 추출액을 감압 농축한 후 100 mg/mL가 되도록 70% 에탄올로 정용하여 시료 용액 으로 사용하였다. 시료 용액은 0.45 μm의 syringe filter를 통과시켜 여과하여 Waters사의 AccQ-Tag Amino Acid Analysis 방법에 따라 유도체화하였다. 여과액 10 μL에 AccQ-Fluor Borate Buffer 70 μL를 넣고 잘 혼합한 후, AccQ-Fluor Reagent 20 μL를 가하여 혼합한 다음에 상온에 서 1분간 방치하였다. 이를 heating block을 이용하여 55℃ 에서 10분간 가열한 후에 기기분석 조건(Column: AccQTagTM Ultra column,　2.1×100 mm, Flow rate: 0.7 mL/min, mobile phase: eluent A, eluent B, UV 260 nm)에 따라 UPLC(Acquity UPLC^® system, Waters, Milford, MA, USA) 으로 분석하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정은 Lee 등(23)의 방법을 응용한 것으로 70% 에탄올로 10배 희석한 추출액 0.2 mL에 0.15 mM DPPH 용액(99% 에탄올 용해) 0.8 mL를 넣고 혼합하 고, 30분 동안 암실에 방치 후 517 nm에서 흡광도를 측정하 였다. DPPH radical 소거 활성은 다음의 계산식을 이용하여 계산하였다.

$\begin{array}{c}\text{DPPH radical 소거 활성(\%) = (대조군의 흡광도-시료군의}\\ \text{흡광도)/대조군의 흡광도)×100}\end{array}$

된장 시료의 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-ciocalteu’s법 (24)을 응용한 것으로 에탄올 추출물 250 μL에 folin ciocalteu reagent 1 mL와 1 N Na₂CO₃ 2 mL를 가하여 혼합한 다음 1시간 동안 암실에서 방치한 후 분광광도계를 사용하 여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 표준물질로 tannic acid를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 환산하여 나타내었다.

된장 중 총 균수와 곰팡이수의 변화를 측정하기 위하여 각 시료 1 g을 멸균 생리식염수로 십진 희석한 후, 일정량을 취하여 총 균수는 tryptic soy agar(30℃, 24시간), 곰팡이는 potato dextrose agar(30℃, 48시간)에 도말하여 배양한 후 형성된 집락을 계수하여 산출하였다.

모든 실험은 3회 반복 측정하였고, 결과는 평균값±표준 편차로 나타내었다. 각 실험구 간의 유의성(p<0.05) 검증을 위해 통계적 분석은 SAS(Statistical Analysis System program, SAS Institute., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하 여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)한 후 Duncan's multiple range test로 다중비교를 실시하였다.

된장 제조 시간을 단축하기 위하여 A. oryzae 곰팡이를 종균으로 하여 담근 콩알메주된장에 단백질 분해효소를 처리하여 된장 중 단백질 가수분해물의 이화학적 특성 변화 를 살펴보았다.

먼저 콩알메주 된장의 수분함량 및 염도 변화를 측정하 여 Table 1에 나타내었다. 된장의 수분함량은 단백질 분해 효소 첨가 된장의 경우 56.24-58.17%로 무첨가 된장의 57.05-59.30%보다 낮은 수분함량을 보였고, 발효가 진행됨 에 따라 점차 감소하는 경향을 보였다. 특히 단백질 분해효 소 첨가 된장의 경우 담금 초기에는 그다지 뚜렷한 차이를 보이지 않다가 발효 8주차에 유의적으로 감소하는 경향을 보였다(p<0.05). Kim 등(25)은 단백질 분해효소 생성 곰팡 이로 제조된 된장의 경우 초기 52.9%에서 발효 90일 후 48.6%로 감소하였으며, 이는 발효 중 수분의 증발에 의한 것이라고 보고하여 본 실험결과와 마찬가지로 단백질 분해 효소에 의해 수분함량이 낮아지는 비슷한 경향을 나타내었 다.

된장의 염도는 단백질 분해효소 첨가 및 발효시간의 경 과에 따른 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았는데, 이는 Choi 등(26)의 보고에서도 다양한 염도에서 제조한 된장이 발효 기간 경과에도 불구하고 담금 초기의 염도 값에서 큰 변화 가 없었다는 보고와 유사한 경향을 보였다.

단백질 분해효소 처리가 콩알메주된장 중 산 생성에 미 치는 영향을 살펴보기 위해 pH와 적정산도를 측정하여 Table 1에 나타내었다. 된장의 pH는 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 5.60-5.90, 무첨가 된장의 5.68-5.95를 보여 효 소 첨가에 따른 pH 변화는 없었지만, 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 발효 8주차에 Protease A, A+B, B 처리군 순으 로 유의적으로 높은 pH를 나타내었으며, 발효시간의 경과 에 따라서는 유의적으로 점차 감소하는 경향을 보였다 (p<0.05).

된장의 적정산도는 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 0.98-1.98%로 무첨가 된장의 0.85-1.80%보다 높은 산도값 을 보였고, Protease B 첨가 된장의 경우 발효 초기 0.98%로 낮은 적정산도를 보였지만 시간의 흐름에 따라 큰 폭으로 증가하여 발효 8주차에 1.98%로 가장 높은 값을 나타내어 Protease A 첨가 된장과도 차이를 보였으나, 모든 실험구에 서 발효가 진행됨에 따라 유의적으로 증가하는 경향을 보였 다(p<0.05). 이는 된장이 미생물 대사 작용으로 인해 생성되 는 유기산의 증가로 산도가 증가하였고, 이에 따라 pH도 감소한 것으로 판단되는데, Park 등(27)의 보고에서 된장 저장 중 일어나는 pH 감소와 산도의 증가는 발효 중에 생성 되는 산에 의한 영향이라 하였고, 염도, 발효온도 등에 따라 상당한 차이를 보인다고 언급하였다. 또한 단백질 분해효 소들 간에 pH 및 산도 차이는 사용한 효소들의 최적 pH가 달라 나타난 현상으로 된장 내 산성 환경이 Protease B가 활성화하는데 좀 더 적합한 것으로 판단된다.

콩알메주 된장 중 생성된 환원당 및 아미노태 질소 함량 변화를 살펴보고 Table 1에 그 값을 제시하였다. 된장 발효 과정 중 미생물이 내는 가수분해효소에 의해 탄수화물 일부 가 분해되어 환원당이 생성되는데, 단백질 분해효소 첨가 된장 중 Protease B를 첨가한 시료들은 높은 환원당 함량을 나타낸 반면, Protease A를 첨가한 된장의 경우 발효 4주차 를 제외하고 무첨가 된장보다 낮은 환원당 값을 보였다. 이 결과는 Park 등(28)이 언급한 대로 발효초기에 미생물이 생육하면서 분비한 탄수화물 분해효소에 의해 가수분해되 어 생성된 환원당 함량이 점차 증가하였고, 일정 발효기간 이 경과한 이후에 된장 내 미생물의 영양원으로 소모 또는 유기산 발효의 기질로 이용되면서 알코올로 분해되어 감소 하는 것으로 사료된다.

Table 1에 나타낸 바와 같이 된장의 아미노태 질소는 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 Protease A+B 혼합처리 구에서 1,003.97 mg%로 가장 높은 아미노태 질소값을 보였 고, 단백질 분해효소 무첨가 된장의 경우 발효 8주차에 823.57 mg%로 가장 낮은 아미노태 질소값을 보였으 며, 무첨가 된장과 Protease A 첨가 된장은 4주차에 가장 높은 값을 나타내었고, Protease B 첨가 된장과 Protease A+B 혼합첨가 된장은 8주차에 유의적으로 가장 높은 값을 나타내었다(p<0.05). Kim 등(29)의 시판 재래식 된장의 아 미노태 질소는 252.0-557.0 mg%로 본 실험의 발효 8주차의 결과보다 낮은 값을 나타내었고, 시판된장의 경우 숙성정 도가 다양하기 때문에 시료마다 차이가 있을 수 있다고 언급하였다. 따라서 단백질 분해효소 처리로 인해 된장 중 단백질 가수분해에 도움을 주면서 아미노산 등이 지속적으 로 생성되어 아미노태 질소 함량이 높은 것으로 사료된다.

단백질 분해효소 처리가 콩알메주 된장의 색도 변화에 미치는 영향을 조사하여 Fig. 1에 나타내었다. 된장의 색도 는 효소처리 유무와 관계없이 명도(L)와 황색도(b)는 발효 가 진행됨에 따라 점차 감소하는 경향을 보인 반면, 적색도 (a)와 변색도(dE) 값은 효소처리에 의해 발효 전후 각각 7.04에서 15.48로, 45.31에서 62.70으로 유의적인 변화를 나타내어 무처리 된장에 비해 높아졌다. No 등(30)의 콩알 메주된장의 경우 제조 직후에 L 값은 45.79-49.22, a 값은 6.06-7.54, b 값은 14.91-17.22에서 발효 60일 후 L 값은 38.56-43.67, a 값은 7.99-9.32, b 값은 11.24-14.38로 L, b 값은 감소하고 a값은 증가하여 본 실험과 비슷한 결과를 나타내었다.

Fig. 1. Color change of Doenjang fermented with Aspergillus oryzae SCF-6 and protease.

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단백질 분해효소 처리가 콩알메주 된장 중 생성된 전분 분해효소 및 단백질 분해효소 활성에 미치는 영향을 살펴본 후 Table 2에 그 값을 나타내었다. 된장의 α-amylase 활성은 Protease B와 Protease A+B 혼합처리구의 경우 발효 4주차 까지 각각 0.52 unit/g과 0.44 unit/g으로 활성이 증가하다가 이후로 점차 감소하는 경향을 보였고, Protease A 첨가 된장 과 무첨가 된장의 경우 발효초기부터 0.06 unit/g로 낮은 값을 나타내다가 발효 8주차에 0.03 unit/g로 활성을 거의 나타내지 않았다. Joo 등(31)의 A. oryzae를 이용한 된장의 경우 0일차부터 60일까지 증가와 감소를 반복하다가 이후 에 현저히 감소하는 경향을 보였고, Kim(21)에 의하면 담금 초기 된장의 원료인 콩에 소량 함유되어 있는 탄수화물이 amylase의 기질이 됨에 따라 효소 활성이 높았다가 발효가 진행되면서 기질이 소모되어 그 활성이 떨어진 것으로 보고 하였는데, 단백질 분해효소 무첨가 된장과 Protease A (alkaline) 첨가 된장의 경우 Protease B 첨가 된장과 Protease A+B 혼합 처리한 된장 시료보다 낮은 환원당 함량을 보여 본 실험과 비슷한 경향을 보였다.

된장의 protease 활성은 단백질 분해효소를 첨가한 된장 의 경우 481.25-757.78 unit/g으로 발효 8주까지 증가와 감소 를 반복하였고, 무첨가 된장의 경우 168.06-261.25 unit/g으 로 발효 2주까지 증가하였다가 이후 감소하는 경향을 보여 가장 낮은 활성을 보였으며, 모든 시험구의 8주차는 0주차보다 낮은 단백질 분해효소 활성을 보였다. Kim등 (25)의 전통메주로부터 분리한 단백질 분해효소 생성 곰팡 이로 제조된 된장의 경우 발효 초기 75.39 unit/g에서 숙성 30일에 105.6 unit/g으로 점차 증가하여 이후에는 계속 감소 하는 경향을 나타내었고, 이는 단백질 분해효소 작용으로 불용성 단백질이 가용성 단백질 또는 peptide 형태로 가수 분해 되어 활성도가 증가하지만 사용한 균주의 차이에 따라 큰 차이가 난다고 보고하였다.

콩알메주 된장의 효소처리 유무 및 발효기간 경과에 따 라 가수분해되어 생성된 유리아미노산 함량 변화를 측정하 여 Table 3에 나타내었다. 된장의 유리 아미노산은 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 Protease A, B, 그리고 A+B 혼합처리 된장 모두 발효 전(0주차)과 발효 후(8주차)에 glutamic acid 함량이 가장 높은 값을 나타내었고, Protease A+B 혼합처리구에서는 0주차에 glutamic acid에서 8주차에 phenylalanine으로 가장 높은 값을 나타내었고, 단백질 분해 효소 무첨가 된장의 경우 glutamic acid가 0주차, 8주차 모두 가장 높은 값을 나타내었다. 시간의 흐름에 따라 모든 실험 구에서 감칠맛을 내는 aspartic acid와 glutamic acid는 증가 하였고, 쓴맛을 내는 methionine과 valine은 감소, isoleucine, lucine, phenylalanine은 증가하였다. Kim과 Rhee(32)의 개 량식 된장의 유리아미노산 측정결과 glutamic acid 함량이 가장 높았으며, 다음으로 aspartic acid, leucine, lysine, alanine 순이라고 보고하였는데, 본 실험 결과와는 조금 다 른 경향을 보였지만, An 등(33)의 메주균을 달리하여 제조 한 된장의 유리아미노산은 A. oryzae구의 된장에서는 glutamic acid, phenylalanine, lucine이 높았다고 보고하여 본 실험과 유사한 경향을 보였다. 이는 된장 내 존재하는 미생물에 의해 생성된 단백질 분해효소의 작용으로 인 해 자연적으로 발효되면서 단백질 분해효소 무첨가 된장에 비해 증가한 아미노산은 Protease A 처리 시 arginine, lucine, tryptophan, phenylalanine 등 4종이고, B 처리한 경우 histidine, serine, glycine, threonine, proline, isoleucine, lucine, phenylalanine 등 8종이며, A+B 처리 시 histidine, serine, glycine, threonine, proline, tryptophan, isoleucine, lucine, phenylalanine 등 9종으로 Protease B가 Protease A에 비해유리아미노산생성에더깊이관여하는것으로판단된다.

콩알메주 된장을 제조하여 효소처리 유무 및 발효 기간 경과에 따른 항산화 활성 변화를 비교하여 Table 4에 그 값을 제시하였다. 된장의 DPPH 라디칼 소거 활성은 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 Protease B 단독, A+B 혼합처리 구, Protease A 단독처리구 순으로 높은 소거 활성을 나타내 었지만 통계적으로 유의적인 차이를 보이지는 않았고 (p>0.05), 단백질 분해효소 무첨가 된장의 경우 8.93-28.87% 로 가장 낮은 값을 보였으며, 모든 실험구에서 시간의 흐름 에 따라 증가하는 경향을 보였다(p<0.05). Ahn 등(34)은 DPPH 라디칼 소거능의 차이가 나타나는 것은 된장의 주원 료인 콩의 발효상태에 따라 콩 단백질로부터 분해된 아미노 산의 종류와 함량 차이에 의해 발생하는 것으로 보고하여 본 실험의 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 단백질 분해 효소 무첨가 된장보다 효소에 의해 아미노산의 함량이 증가 하여 높은 값을 나타낸 것으로 사료된다.

된장의 효소처리 및 발효기간 경과에 따른 총 폴리페놀 함량 변화를 살펴본 결과, 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 Protease B가 0.78-2.24 mg TAE/g으로 가장 높은 함량 을 나타내었고(p<0.05), 무첨가 된장의 경우 발효 4주차를 제외하고 0.60-1.86 mg TAE/g으로 실험구 중 가장 낮은 값을 보였으며, 모든 실험구에서 발효가 진행되면서 총폴 리페놀 함량이 증가하는 경향을 보였다(p<0.05). Ku 등(35) 은 콩 등 식물체에 포함된 페놀성 화합물은 대사산물의 하나로 특히 phenolic hydroxyl기가 항산화 생리활성을 가 진다고 알려져 있어 발효 숙성 과정에서 페놀성 물질인 이소플라본 배당체가 aglycon 형태인 genistein과 daidzein 등으로 변환되어 발효되지 않은 콩보다 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 보고하였는데, 이번 결과에서는 발효초기에 는 실험구간에 유의적으로 차이를 보이지 않았지만 발효가 진행됨에 따라 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 단백질 분해효소로 인해 폴리페놀 함량이 증가하면서 8주차에는 유의적인 차이를 보여 콩 발효 시 이소플라본 등과 같은 유용한 폴리페놀 물질의 분리에도 관여하는 것으로 사료된 다.

단백질 분해효소 처리에 따른 발효기간 중 콩알메주 된 장의 미생물수 변화를 관찰하여 Fig. 2에 그 값을 제시하였 다. 콩알메주 된장 시료 중 총균수 변화는 단백질 분해효소 의 첨가 유무와 상관이 발효가 진행됨에 따라 증가와 감소 를 반복하였는데, 발효 8주차에서 7.76-7.98 log CFU/g를 보여 0주차 8.15-8.50 log CFU/g 보다 낮은 값을 나타내었다. 된장 내 곰팡이수는 단백질 분해효소 첨가 유무와 상관없이 발효 초기에 6.45-5.65 log CFU/g 값을 나타내었다가 발효 기간 내 꾸준히 감소하는 경향을 보였으며, 발효 8주차에 모든 실험구에서 전혀 검출되지 않았다. Lee 등(36)은 재래 식 된장의 경우 숙성 60일 이후 호기성균이 8 log CFU/g으 로 120일까지 큰 변화가 없다고 보고하였고, Park 등(27) 역시 매실 첨가 된장의 경우 7.02 및 7.23에서 발효 8주차에 6.69 및 6.64 log CFU/g로 감소하였다고 언급하였으며, Rhee 등(37)이 보고한 표고버섯 첨가 된장에서도 시간의 흐름에 따라 감소하는 경향을 보여 본 실험결과와 유사한 경향을 보였다.

Fig. 2. Change on total bacter ial and fungi number of Doenjang fermented with Aspergillus oryzae SCF-6 and protease.

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