이팝나무 꽃에서 분리한 페놀 화합물의 생리활성 효소 억제효과

본 연구에서 사용된 이팝나무 꽃은 실험을 위해 대구 지역에서 개화시기인 4월에 직접 채취하여 45℃ dry oven(FO600M, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 수분이 완전 히 날아갈 때까지 열풍 건조시킨 후 40 mesh로 분쇄하여 시료로 사용하였다.

추출물의 제조는 열수 추출물의 경우 이팝나무 꽃 건조 분말 1 g을 증류수 200 mL에 침지하여 추출물이 100 mL가 될 때까지 hot plate에서 가열한 후 실온에서 냉각하여 24시 간 동안 교반 추출하였으며, ethanol 추출물의 경우에는 전 보(19)에서와 같이 이팝나무 꽃 건조 분말 1 g에 90% ethanol 100 mL를 첨가하여 4℃의 shaking incubator에서 24시간 동안 교반 추출하였다. 각 추출물은 Whatman No.1 filter paper로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator (Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축하여 시료의 phenolic compounds 농도를 50, 100, 150, 200 μg/mL phenolics 농도 로 설정하여 4℃ sample 보관 냉장고에서 저온 보관하며 시료로 사용하였다.

XOase 저해 효과 측정은 Stirpe와 Corte의 방법(20)에 준 하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 녹인 기질액 2 mM xanthine 3 mL에 효소액 (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA, 0.05 U/0.1 mL) 0.1 mL와 시료 0.3 mL를 넣고 대조구에는 시료 대신 시약반 응과 관계없는 증류수를 0.3 mL 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시키고 종료시약 20% TCA 1 mL를 가한 후 반응액을 원심분리하여 단백질을 제거하였다. 생성된 uric acid를 흡 광도 292 nm에서 측정하였으며, 실험에 대한 positive control은 allopurinol을 사용하였다. 저해율(%)은 (1-시료의 uric acid 함량/대조구의 uric acid 함량)×100으로 계산하였다.

α-Glucosidase 저해 효과 측정은 Tibbot와 Skadsen의 방법 (21)에 준하여 측정하였다. 50 mM sodium succinate buffer(pH 6.8)에 ρ-nitrophenol-α-D-glucopyranoside(PNPG) (Sigma-Aldrich Co.)를 용해시켜 1 mg/mL 농도로 기질을 만들고, 기질 2 mL와 효소액 0.1 mL를 혼합하여 반응구에 는 시료 0.1 mL, 대조구에는 증류수 0.1 mL를 넣어 37℃에 서 30분간 반응시킨 후 반응종료시약 5% Na₂CO₃를 첨가하 였다. 이때 생성된 ρ-nitrophenol을 흡광도 470 nm에서 측정 한 후 표준곡선에 대입하여 양을 환산하였으며, 실험에 대 한 positive control은 epigallocatechin gallate(EGCG)를 사용 하였다. 저해율(%)은 (1-시료의 ρ-nitrophenol 함량/대조구 의 ρ-nitrophenol 함량)×100으로 계산하였다.

Tyrosinase 저해 효과 측정은 Vincent와 Hearing의 방법 (22)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 2.3 mL와 기질액 1.5 mM L-tyrosine 용액 0.4 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich Co., 250 U/mL) 0.1 mL와 시료 0.2 mL를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수를 0.2 mL를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응액은 흡광도 475 nm에서 측정하였으며, 실험에 대한 positive control은 kojic acid를 사용하였다. 저해율(%)은 (1-시료의 absorbance/대조구의 absorbance)×100으로 계산하였다.

Collagenase 저해 효과 측정은 Wunsch와 Heidrich의 방법 (23)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여, 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3 mg/mL)를 녹인 기 질액 0.25 mL 및 시료용액 0.1 mL의 혼합액에 0.2 mg/mL collagenase(Sigma-Aldrich Co.) 0.15 mL를 첨가하였다. 대 조구에는 시료 대신 증류수 0.1 mL을 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5 mL를 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 2 mL을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해 효과 측정은 Kraunsoe 등의 방법(24)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 1 mL에 기질액 0.8 mM N-succinyl- (Ala)3-ρ-nitroanilide 용액 0.1 mL의 혼합액에 1.0 U/mL porcine pancreatice elastase(PPE)(Sigma-Aldrich Co.) 효소 용액 0.1 mL와 시료 0.1 mL를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시켜 ρ -nitroaniline 생성량을 흡광도 410 nm에서 측정하였으며, 실험에 대한 positive control은 EGCG를 사용하였다. 저해 율(%)은 (1-시료의 absorbance/대조구의 absorbance)×100 으로 계산하였다.

HAase 저해 효과 측정은 Dorfman와 Ott의 방법(25)에 준하여 측정하였다. 반응구는 시료 0.5 mL에 20 mM sodium phosphate buffer(pH 6.9)에 녹인 HAase(1,000 U/mL) 0.5 mL을 혼합하여 38℃에서 5분간 반응시키고 0.3 M phosphate buffer(pH 5.3)에 녹인 기질(4 mg/mL) 0.5 mL을 넣어 다시 38℃에서 45분간 반응시킨 후 0.04 M acetate buffer(pH 3.75)에 녹인 알부민용액 5 mL을 첨가한 후 5분간 방치하고 600 nm에서 투과율을 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수 0.5 mL를 넣어 반응시켰으며, 실험에 대한 positive control은 ammonium pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)를 사용하였다. 저해율(%)은 (1-시료의 투과율/대 조구의 투과율)×100으로 계산하였다.

모든 실험은 6회 이상 반복 측정하여 평균±표준편차 (mean±SD)로 표시하였고, 실험구간 차이검정은 IBM SPSS Statistics(23, IBM Corp, Armonk, NY, USA)를 이용하여 분산분석과 Duncan’s multiple range test로 수행하였다 (p<0.05).

전보(19)에서 이팝나무 꽃의 열수, ethanol 추출물에서 각각 20.8, 32.3 mg/g의 phenolic compounds의 높은 함량을 나타내었으며, 항산화 효과 측정을 통해 생리활성을 나타 내는 물질이 phenolic compounds라는 것을 입증한바, 본 연구에서도 이팝나무 꽃에서 분리된 phenolic compounds의 농도별 생리활성 효소 저해 효과를 살펴보았다. 생체 내 유리기 생성계의 하나인 XOase는 purine, aldehyde류, pyrimidine, pteridine 및 heterocyclic compound 등의 생체 내 대사에 관여하는 비특이적 효소이다. 생체 내에서는 주 로 방향족성 유기 화합물인 purine 유도체와 그 대사산물인 hypoxanthine을 xanthine으로, xanthine을 다시 산화시켜 불 용성 질소화합물인 uric acid(urate)를 생성하는 반응의 촉매 로 작용한다(3). 사람 혈액 내 uric acid의 정상 수치는 남자 의 경우 80 mg/L이고, 여자의 경우 80 mg/L인데 uric acid 수치가 높아지고 원활한 배출이 되지 않을 때 통풍이 일어 나게 되고, uric acid가 관절에 침상 결정체를 이루어 달라붙 어 염증이 발생한다. 심한 경우 신장이나 심장 등에 합병증 또는 만성질환을 유발하기도 한다(26). 이팝나무 꽃에서 분리된 phenolic compounds의 농도별 추출물을 이용하여 uric acid를 생성하여 통풍을 일으키는 XOase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 1에서와 같이 50-200 μg/mL의 phenolic 농도에서 열수 추출물에서는 14.94-25.60%로 저해 효과가 유의하게 증가하는 것을 확인하였고, ethanol 추출물은 0.17-15.92%의 저해 효과를 나타내어 저농도의 phenolic 농도에서 고농도로 농도 의존적으로 유의하게 증가하여 phenolic 농도에 따라 저해 효과가 증가하는 것을 확인하였 다. Positive control로 사용한 allopurinol은 50-200 μg/mL의 농도에서 67.10-80.96%로 나타내어 농도별로 유의한 저해 효과를 확인하였다. 높은 효과를 나타낸 allopurinol은 uric acid 수치를 낮춰주는데 사용되는 약물이지만, 가려움, 발 진, 구토 및 신장에 문제를 일으킬 수 있다고 알려져 있어서 천연물 소재의 안전한 대체제가 필요한 실정이다. Kim 등 (27)은 현재 한약재로 쓰이고 있는 유근피 추출물의 200 μg/mL phenolics 농도에서 48.1%의 XOase 억제력을 나타내 었다고 보고한 것과 같이 이팝나무 꽃 추출물에서도 XOase 저해 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

Fig. 1. Inhibition activity of water and ethanol extracts on xanthine oxidase from C. retusus flower . Means with different letters (a-c) on the same extract bars are significantly different at p<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.

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α-Glucosidase는 탄수화물의 소화과정에서 마지막 단계 를 촉매하며, β-glucosidase와 반대로 (1→4)결합된 α -glucose 잔기를 가수 분해하여 단일 α-glucose 방출하는 탄수화물 가수분해효소이다. α-Glucosidase의 활성을 저해 시키면 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시키게 되어 식후 혈당증가를 완화시킬 수 있어서 제 2형 당뇨병의 치료제로 적용이 가능하다(4). 이팝나무 꽃에서 분리된 phenolic compounds의 농도별 추출물을 이용하여 효모기원 α -glucosidase에 대한 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 2에서와 같이 열수 추출물에서는 저해 효과가 나타나지 않았으며, ethanol 추출물에서는 50-200 μg/mL의 phenolic 농도에서 6.85-100.00%로 나타내어 phenolic 농도별로 저해 효과가 유의하게 증가하는 것을 확인하였고, 200 μg/mL의 고농도 에서는 우수한 효능을 나타내었다. 이러한 결과는 각각 다 른 추출 용매인 열수, ethanol에서 추출되는 phenolic compounds가 다르기 때문에 α-glucosidase에 대한 저해 효 과가 다르게 나타난 것으로 보이며, 이에 따른 후속연구로 phenolic compounds의 성분을 규명할 필요성이 있다고 판 단되었다. Choi(28)는 목이버섯 추출물이 200 μg/mL의 농 도에서 80%의 높은 α-glucosidase 저해 효과를 보고한 바 있다. 이팝나무 꽃 ethanol 추출물은 positive control로 사용 한 EGCG와 비교하였을 때 고농도에서는 비슷한 효능을 나타내어 α-glucosidase 억제제로 사용가능성을 확인하였 다.

Fig. 2. Inhibition activity of water and ethanol extracts on α -glucosidase from C. retusus flower. Means with different letters (a-d) on the same extract bars are significantly different at p<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.

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Melanin은 동물의 조직 및 피부에 존재하는 갈색 또는 흑색의 색소이며, 인체 피부의 색소 침착과 피부의 흑화 현상의 원인물질이다. 피부가 광노화 되는 것이나 일광 각 화증을 억제하는 등 긍정적인 기능과 더불어 피부 미용상 문제를 일으키는 과다한 색소 침착이나 멜라닌의 전구체의 독성으로 인한 세포사멸 등 부정적인 면도 가지고 있다. Tyrosinase는 monophenol의 수산화 과정이나 o-diphenol이 o-quinone로 전환되는 과정에 관여하여 melanin의 생성을 조절하는 효소이다(5). 이팝나무 꽃에서 분리된 phenolic compounds의 농도별 추출물을 이용하여 melanin 생성을 조절하는 tyrosinase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 3에서와 같이 열수 추출물 50-200 μg/mL의 phenolic 농도에서 1.96-17.27%의 저해 효과를 나타내었고, ethanol 추출물 50-200 μg/mL의 phenolic 농도에서 19.33-36.13%의 저해 효과를 나타내었다. 따라서 열수, ethanol 추출물 모두 50-200 μg/mL의 phenolic 농도로 농도가 증가함에 따라 의 존적으로 유의하게 저해 효과가 증가하는 것을 확인하였 다. Mo와 Oh(29)는 측백나무 에탄올 추출물을 5, 10, 20, 50 μg/mL의 농도로 설정하여 tyrosinase 저해 효과를 측정한 결과 8.75, 15.1, 29.1, 31.2%의 저해 효과를 나타내었다고 보고하였다. 이는 이팝나무 꽃 추출물과 유사한 효능을 나 타내어 피부색소 침착 등을 방어할 수 있는 미백 기능성화 장품의 소재로서 활용 가능하다고 판단되었다.

Fig. 3. Inhibition activity of water and ethanol extracts on tyrosinase from C. retusus flower . Means with different letters (a-d) on the same extract bars are significantly different at p<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.

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세포외기질(extracellular matrix)의 70-80% 차지하는 collagen은 피부의 섬유아세포에서 생성되어 대부분 진피 층에 존재한다. 기질의 주요 단백질인 collagen은 피부에 기계적 견고성과 결합조직의 저항력, 조직력, 세포분할과 분화를 유도하는 기능이 있으나 자연노화에 따른 세포 활성 감소와 같은 내적 요인과 여러 유해환경에 의한 스트레스 증가, 자외선 조사에 의한 광노화와 같은 외적 요인에 의해 collagen이 분해된다(6). 피부 진피의 노화가 진행되면 collagen양이 현저하게 감소되며, collagen을 분해하는 collagenase의 발현이 더욱 증가되어 피부 탄력 저하를 야기 시켜 피부의 주름과 피부 처짐의 원인이 된다(30). 이팝나무 꽃에서 분리된 phenolic compounds의 농도별 추출물을 이 용하여 피부의 주름과 처짐을 유발하는 collagenase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 4A에서와 같이 열수 추출물 50-200 μg/mL의 phenolic 농도에서 2.58-20.21%로 농도에 따라 유 의하게 저해 효과가 증가하는 것으로 나타났고, ethanol 추 출물 50-200 μg/mL의 phenolic 농도에서 38.82-96.26%로 농도별로 매우 높은 collagenase 저해 효과를 나타내었으며, 유의성 또한 확인하였다. Ahn 등(31)은 추출용매에 따른 함초 추출물의 collagenase 저해 효과를 측정한 결과, 100 μg/mL 농도에서 29.7%의 저해 효과를 나타내었으며, Lee 등(32)의 배롱나무 가지 추출물의 경우 50 ppm에서 85%를 나타내었다고 보고하였다. 따라서 이팝나무 꽃 추출물의 collagenase 저해 효과가 우수하다고 판단되었다. 위의 결과 에 따라 이팝나무 꽃 추출물이 가지는 collagenase 저해력을 이용한 주름개선을 위한 기능성 미용식품 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.

Fig. 4. Inhibition activity of water and ethanol extracts on collagenase (A), and elastase (B) from C. retusus flower. Means with different letters (a-d) on the same extract bars are significantly different at p<0.05 by a Duncan’s multiple range tests

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Elastase는 진피 내에서 피부탄력을 유기하기 위해 elastin, elastic fibre, collagen으로 결정 결합 조직을 이루고 있는 기질 단백질을 포함한 다양한 단백질을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 피부세포 기저층의 그 물망 구조를 끊어 주름이 생성되도록 하는 주효소이며, 최 근에는 피부 탄력섬유의 3차원적 뒤틀림에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있다(7). 이팝나무 꽃에서 분리된 phenolic compounds의 농도별 추출물을 이용하여 elastin을 분해해 주름 생성을 유발하는 elastase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 4B에서와 같이 열수 추출물에서는 저해 효과가 나타나 지 않았으며, ethanol 추출물 50-200 μg/mL phenolics 농도에 서 10.28-35.93%의 저해 효과를 나타내어 저농도의 phenolic 농도에서 고농도로 농도 의존적으로 유의하게 증 가하여 phenolic 농도에 따라 저해 효과가 증가하는 것을 확인하였다. Kim 등(33)은 유근피 ethanol 추출물을 200 μg/mL phenolics 농도로 처리했을 때 53.5%의 elastase 저해 효과를 나타내었다고 보고하였으며, 이팝나무 꽃 추출물에 서도 elastase 저해 효과를 확인할 수 있었다.

체내에서 염증반응이나 혈관 투과성에 관여하는 HAase 는 선형의 glycosaminoglycan 중합체인 hyaluronic acid(HA) 의 glucuronic acid와 N-acetylglucosamine의 β-1,4 결합을 절단한다(34). HA는 extracellular matrix의 주요 구성분 중 의 하나로서 주로 뇌, 근육, 연결조직, 탯줄, synovial fluid, 연골 등에서 흔히 존재하는 고분자의 물질이며, 염증 형성 의 중요 요인인 macrophage의 phagocytic ability를 저해하고 HA의 분해산물 혹은 저분자의 HA는 상처 치유 과정에서 inflammation, fibrosis, collagen deposition을 증가시킨다. 그 러므로 HAase의 활성 저해는 HA의 분해를 억제시켜 항염 증 및 항알레르기 효과를 기대할 수 있다(8). 이팝나무 꽃에 서 분리된 phenolic compounds의 농도별 추출물을 이용하 여 HA를 분해해 염증을 유발시키는 HAase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 5에서와 같이 열수 추출물 50-200 μg/mL phenolic 농도에서 21.88-36.69%의 저해 효과를 나타내었 고, ethanol 추출물은 50-200 μg/mL phenolic 농도에서 9.82-88.70%의 저해 효과를 나타내었다. 이팝나무 꽃 추출 물은 positive control로 사용한 PDTC의 9.88-78.17% 저해 효과보다 더 우수한 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었 다. 위의 결과에 따라 이팝나무 꽃 추출물은 열수, ethanol 추출물 모두 농도에 따라 저해 효과가 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 각각의 추출물에 함유된 phenolic compounds의 종류와 농도의 차이에 따라 효소의 저해 효과 에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이팝나 무 꽃 추출물은 항염증 및 항알레르기 제품에 작용할 수 있는 기능성 소재로 개발 가능할 것으로 판단되었다.

Fig. 5. Inhibition activity of water and ethanol extracts on hyaluronidase from C. retusus flower . Means with different letters (a-d) on the same extract bars are significantly different at p<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.

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