건조방법에 따른 미선나무 잎의 항산화 및 항염증 효과

본 연구에 사용된 미선나무 잎은 충북 괴산군 괴산읍 충민로기곡길 78 성불산자연휴양림 미선향 테마파크에서 인공증식 재배지로부터 채취 및 건조하였으며, 중원대학교 생약자원개발학과에서 동정된 시료를 사용하였다(voucher number: JWU-031). 본 실험에 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), 10%(v/v) fetal bovine serum, penicillin/streptomycin, trypsin은 Hyclone(Laboratories Inc., Logan, UT, USA) 제품을사용하였다. HPLC grade의methanol, petroleum ether, ethyl acetate, chloroform, acetonitrile 및 dimethyl sulfoxide는 Merck(HPLC grade, Frankfurter, Darmstadt, Germany)사의 제품을 사용하였다. 나머지 시약 은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하 였다. 기타 시약 및 기기는 별도 표기하였다. 모든 항체는 abcam(Cambrige, MA, USA)의 제품을 사용하였다.

미선나무 잎은 생체 및 건조 시료로 구분하였다. 생체 미선나무 잎(생잎)은 채취 즉시 사용하였으며, 건조시료(건 조잎)는 7일간 음건하여 시료로 사용하였다. 각 시료 100 g에 증류수 1 L로 침지하여 autoclave에서 121℃, 1.2 atm 조건으로 15분 간 추출하였으며, 이 추출물을 동결건조하 여 시료로 사용하였다.

DPPH를 이용한 전자 공여능은 Bondet 방법(17)을 참고 하여 측정하였다. DPPH solution은 300 μM 1,1-diphenyl- 2-picryl hydrazyl(DPPH)를 515 nm에서 흡광도 값이 1.00이 되도록 ethanol을 이용하여 희석 준비하였다. 각 농도별 추 출물(0.32, 1.6, 8, 40, 200 μg/mL) 40 μL에 DPPH solution 760 μL를 첨가한 후 37℃에서 20분 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer(Xma-3000PC, Human Co., Seoul, Korea) 를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성 능력은 Van den Berg 등의 방법 (18)을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 7.4 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합하여 24시간 ABTS radical을 형성시킨 후 증류수를 이용하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.70이 되도록 희석하였다. 각 농도별 추출물 40 μL에 ABTS solution 760 μL를 첨가한 후 37℃에서 20분 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer (Xma-3000PC, Human Co.)를 이용하여 734 nm에서 흡광도 를 측정하였다.

환원력은 Oyaizu의 방법(19)을 참고하여 측정하였다. 각 농도별 추출물 100 μL에 0.2 M potassium phosphate buffer(pH 6.6) 250 μL과 1% potassium hexacyanoferrate(Ⅲ) 250 μL을 혼합한 후, 50℃에서 20분 반응시킨 후 찬물로 냉각하여, trichloroacetic acid(TCA) 250 μL를 첨가하였다. 위 반응액을 2,000 ×g에서 5분간 원심 분리하여 상등액 400 μL에 증류수 400 μL와 0.10% ferric chloride 16 μL를 첨가하여 혼합한 후, UV/Visible spectrophotometer(Xma- 3000PC, Human Co.)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측 정하였다.

총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법(20)을 참고하여 측정하 였다. 추출물 50 μL와 증류수 950 μL, Folin 500 μL를 혼합한 후, 20% sodium carbonate 2.5 mL를 넣어 40분간 실온에서 반응시켰다. 반응물을 흔들지 않고 맑은 액체를 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정 하였다. Standard는 tannic acid를 사용하였고, 정량 직선방 정식을 사용하였다.

Acteoside의 High performance liquid chromatography (HPLC) 분석은 Waters 2695 system(Waters, Milford, MA, USA)과 Waters 2487 Dual λ absorbance detector(Waters)를 통해 분석하였다. 실험에 사용된 시료 및 표준품은 1 mg을 취하여 1 mL의 메탄올에 용해하여 0.45 μm membrane filter(Waters)를 이용해 여과하였고, 시료 10 μL를 acetonitrile 및 1% acetic acid/H₂O를 1 mL/min로 0-20분까지 10:90에서 50:50로 변화하는 용매 비율로 분석하였다. Waters XBridge^TM C₁₈ column(4.6 mm×250 mm) packed with 5.0 μm diameter particles(Waters)를 이용하여 흡광도 335 nm에서 분석하였 으며, 시료의 acteoside 함량은 표준품과 비교하여 동정 및 정량하였다. 표준품은 Sigma-aldrich사의 제품을 이용하였 으며, 표준품의 정량 직선방정식을 사용하여 정량하였다.

본 연구에 사용된 Raw 264.7 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받 아 실험하였다. 세포는 1% penicillin/streptomycin 및 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에 배양하였다.

Raw 264.7 세포를 96-well plate에 1.0×10⁴ cells/well의 밀도로 분주하여, 24시간 배양한 후 농도 별로 시료를 처리 하였다. 시료 처리 24시간 후 alamarBlue® Cell Viability Reagent(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 배지의 총량의 20%씩 처리하여 2시간 배양하였다. 반응 후 UV/Visible spectrophotometer(Xma-3000PC, Human Co.) 을 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다.

Raw 264.7 세포를 96-well plate에 1.0×10⁴ cells/well의 밀도로 분주하여, 24시간 배양한 후 농도 별로 시료를 처리 하였다. 시료 처리 1시간 후 LPS를 처리하여 24시간 배양한 상등액을 NO 생성량 측정에 사용하였다. 세포 상등액에 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylenediamine dihydrochloride, and 2.5% phosphoric acid)를 처리하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Raw 264.7 세포를 6-well plate에 1.0×10⁵ cells/well의 밀 도로 분주하여, 24시간 배양한 후 농도 별로 시료 및 LPS를 처리하였다. 시료 처리 24시간 후 PBS로 두 번 세척한 후, protease inhibitor cocktail을 포함한 Radio Immuno Precipitation Assay(RIPA) buffer로 용해한 후 얼음에서 30 분간 정치시켰다. 세포 용해액을 4℃, 12,000 rpm에서 20분 간 원심분리하고, 상층액은 Bradford 시약(Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 단백질 정량을 실시하였 다. 세포 용해액은 2×Lamilae buffer와 혼합하여 95℃에서 5분 간 가열 후 각 20 μg 단백질량에 해당하는 시료를 10% SDS-PAGE에서 전기 영동하여 분리하였다. 전기 영동된 단백질은 polyvinylidene difluoride membrane(PVDF) 막에 옮겨 상온에서 1시간 동안 blocking(5% skim milk in TBST) 하였다. 1차 항체를 1:2,000으로 희석하여 4℃에서 overnight 처리하였다. 이후 10분 간격으로 TBST로 3회 세 척하고, 2차 항체 1:5,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시 켰다. 이후 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection kit(Biorad) 로 반응하였다. 단백질 밴드는 FluorChem E(Cell biosciences, Santa Clara, CA, USA)로 촬영하여 확인하였다.

Raw 264.7 세포를 6-well plate에 1.0×10⁵ cells/well로 분 주하여, 24시간 배양한 후 농도 별로 시료를 처리했다. 시료 처리 48시간 후 PBS로 두 번 세척한 후, Nucleo Spin^® RNA Plus(Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 이용하여 total RNA를 얻었다. 모든 과정은 4℃에서 진행되었으며, Quantus fluorometer RNA system(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 정량하였으며, cDNA 합성을 위해 1 μg의 total RNA를 사용하여 ReverTra Ace -α-^®(Toyobo, Osaka, Japan) 를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

cDNA상의 타겟 유전자를 증폭시키기 위하여 Quick Taq^® HS Dye Mix(Toyobo, Osaka, Japan)와 합성한 cDNA, forward primer와 reverse primer로 PCR을 수행하였다. PCR 의 조건은 다음과 같다. 94℃로 2분 간 denaturation을 시킨 후, 94℃에서 30초 간 denaturation 후 55℃에서 30초 간 annealing, 68℃에서 1분 간 extension을 25 cycle 반복하였고 마지막 단계로 72℃에서 10분 간 extension하였다. House keeping gene으로 β-actin을 사용하였고 2% agarose gel(Affymetrix, Cleveland, OH, USA)로 UV 상에서 band를 확인하였다. 각 primer의 서열은 다음과 같다.

iNOS forward 5'-AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT-3', reverse 5'-GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC-3'.

COX-2 forward 5'-GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT-3', reverse 5'-ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA-3'.

GADPH forward 5'-AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG-3', Reverse 5'-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3'

모든 실험 결과는 3번 이상 수행하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0(Statistical Package for the Social Sciences)을 이용 하여 각 실험의 평균과 표준편차를 계산하였고, ANOVA를 통한 p<0.05 수준에서 Duncan 다중검정법(Duncan's multiple range test)으로 사후 검정하여 각 실험의 유의성을 검증하였다.

본 연구는 건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 항산화 및 항염증 활성에 대한 비교 분석을 위해 실행되었 다. 항산화 활성의 기작은 유리기와 반응하는 것으로, 유리 기 소거작용은 활성라디칼(free radical)에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 사용된다. DPPH와 ABTS는 비교적 안정한 라디칼을 갖는 물질로 DPPH 라디칼 소거 활성은 수소 공여체의 활성을 측정하는 방법으로 페놀성 화합물, 방향족 아민류 및 아스 코르빈산 등에 의해 수소나 전자를 받아 환원되어 보라색이 탈색 되는 원리를 이용한 방법이며, 항산화 물질을 탐색하 기 위해 많이 이용되고 있다(21).

건조 방식에 따른 미선나무 잎의 항산화 활성을 평가하 기 위해 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성 및 환원력으로 평가하였다. DPPH 라디칼 소거활성에서 (Fig. 1), 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였으며 건조잎 추출물 농도 200 μg/mL에서 82.7±1.3%, 40 μg/mL에서 68.0±1.1%로 생잎 추출물 90.1±0.9%, 70.7±0.7%과 비교하여 생잎 추출물이 높은 활 성을 나타냈다. 또한 IC₅₀(inhibitory concentration) 값은 건 조잎 22.7 μg/mL, 생잎 18.0 μg/mL으로 나타났다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of fresh and air -dr ied Abeliophyllum distichum Nakai leaves. All data are from one experiment, representing three independent experiments (^*p<0.05, air-dried-treated group vs fresh-treated group).

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ABTS 라디칼 소거활성은 라디칼을 생성하는 ABTS가 존재 시, hydrogen peroxide와 metmyoglobin의 빠른 항산화 반응에 의해 myoglobin radical을 감소시키는 기전으로 소 거활성을 나타낸다. ABTS 라디칼 소거활성에서(Fig. 2), 건조잎 추출물 농도 200 μg/mL에서 94.1±3.6%, 40 μg/mL에 서 90.8±2.8%로 생잎 추출물 95.2±4.1%, 93.5±4.0%와 비교 하여 유의적인 차이를 나타내지 않았지만, 8 μg/mL에서 33.6±2.5%, 38.2±1.6%로 나타났다. 또한 IC₅₀ 값은 건조잎 10.7 μg/mL, 생잎 9.3 μg/mL으로 나타났다. 환원력 평가는 시료의 환원력에 따라 노란색의 실험 용액이 청색 또는 녹색으로 전환되는 원리를 이용한 것이다. 항산화제와 같 은 환원제는 Fe³⁺/ferricyanide complex를 환원시켜 ferrous 형태로 전환하고, 이로 인한 Perl's Prussian blue의 형성을 700 nm에서 측정하는 원리이다(22).

Fig. 2. ABTS radical scavenging activity of fresh and air -dr ied Abeliophyllum distichum Nakai leaves. All data are from one experiment, representing three independent experiments (^*p<0.05, air-dried-treated group vs fresh-treated group).

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건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 환원력(Fig. 3)은 대조군으로 설정한 L-ascorbic acid(100%)와 비교하여 200 μg/mL의 농도에서 건조잎(102.4±0.8%), 생잎(110.9± 1.4%)의 환원력을 나타냈으며, 같은 농도의 대조군과 비교 하여 더 높은 효과를 나타냈다. 또한 생잎 처리군에서는 상당한 환원력을 나타냈다. 이러한 항산화 활성은 전자 공 여능과 밀접한 연관이 있으며 체내에서 생성되는 활성산소 종의 소거활성과 깊은 연관성을 가진다. 건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물은 높은 항산화 효과를 나타냈으며, 통계적으로 생잎의 활성이 건조 잎의 활성보다 높은 유의성 을 나타냈다.

Fig. 3. Reducing power of leaves of fresh and air -dr ied Abeliophyllum distichum Nakai leaves. All data are from one experiment, representing three independent experiments (^*p<0.05, air-dried-treated group vs fresh-treated group).

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건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 페놀류 화합 물을 분석한 결과(Fig. 4), 총 페놀류 화합물의 함량은 건조 잎(13.69 mg/g TAE), 생잎(13.61 mg/g TAE)로 나타났다. 두 시료간의 페놀류 화합물의 함량은 차이가 없었다. 페놀 류 화합물의 항산화 활성은 그 구조적인 특징과 관련성이 높은데, 이들은 금속 킬레이트제, 환원제, 활성산소의 소거 제, 사슬전단 항산화제(chain breaking antioxidants)등으로 서의 역할에 기인하는 것으로 알려져 있다. 총 페놀성 화합 물은 다양한 구조와 분자량을 가진 2차 대사산물로서 항산 화 활성과 항암, 항균, 항염증, 간 보호 효과 등 많은 생리적 작용을 하는 생리활성물질로 알려져 있다(23).

Fig. 4. Total phenolic compounds of fresh and air -dr ied Abeliophyllum distichum Nakai leaves. TAE, tannic acid equivalent.

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건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 acteoside 분석한 결과(Fig. 5), 건조잎(9.5 mg/g), 생잎(13.2 mg/g)으로 생잎의 acteoside 함량이 높았다. 물푸레나무과에 포함된 acteoside는 다양한 생리활성을 나타낸다고 알려져 있으며 (24), 미선나무의 다양한 활성관 연관성이 깊다고 사료된다.

Fig. 5. Chromatogram of identification of acteoside of leaves of Abeliophyllum distichum Nakai according to drying methods by HPLC.

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건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 세포 생존률 은 MTS 분석을 통해 실시하였으며, 25, 50, 100, 200 μg/mL 의 농도로 처리한 결과(Fig. 6), 건조잎 92.9±7.1%, 95.4±6.1%, 91.5±7.1%, 92.0±4.3%으로 나타났으며, 생잎 92.6±9.0%, 93.4±2.3%, 90.0±6.1%, 88.8±6.4%으로 RAW 264.7 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았다. 따라서 건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 세포 독성은 확인되 지 않았다.

Fig. 6. Inhibitory effects of fresh and air -dr ied Abeliophyllum distichum Nakai leaves on cell viability. RAW 264.7 macropahges were stimulated with treatments of air-dried and fresh leaves (0, 25, 50, 100 μg/mL) for 24 h. After incubation for 24 h, cell viability was measured by using the alamarBlue^® Cell Viability reagent. All data are from one experiment, representing three independent experiments. (^*p<0.05, non-treated group vs treated group).

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Pro-inflammatory cytokines, prostaglandins과 NO 생성은 활성화된 대식세포에서 염증 반응에서 중요한 역할을 한다 (25,26). NO는 Inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되며, 정상적인 상태에서는 신경 전달, 혈관 확장, 면역 반응 등의 생리적인 기능을 조절하는 중요한 역할을 하지만(27,28), 염증 반응에서 과발현된 NO 는 혈관 투과성을 증가시켜 부종을 일으키고 염증을 심화시 켜 다양한 세포 및 조직손상을 일으켜 만성 염증 질환 및 자가면역질환 등을 초래하는 것으로 알려져 있다(29). 건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 nitric oxide(NO) 수준 을 확인한 결과(Fig. 7), LPS 처리에 의해 증가된 NO는 처리된 시료에 의해 농도 의존적으로 감소하였다. 추출물 농도 100 μg/mL에서 두 시료간의 차이는 없었지만, LPS 처리군에 비해 약 50% NO 생성량이 감소하였다.

Fig. 7. Inhibitory effects of fresh and air-dried Abeliophyllum distichum Nakai leaves on the production of nitric oxide (NO). RAW 264.7 macropahges were stimulated with treatments of Lipopolysaccharide (LPS), air-dried and fresh leaves (0, 25, 50, 100 μg/mL) for 24 h. After 24 h stimulation, NO secretion in the supernatants was measured by using th Griess reagent. NO secretion was calculated by using a standard curve according to sodium nitrite standard solution. Comparing with non-treated group (^#p<0.05), LPS-treated group (^*p<0.05). All data are from one experiment, representing three independent experiments.

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iNOS의 발현은 세포내 Ca2+ 농도와 관계없이 세균성 독 소 또는 염증 및 면역반응, 허혈, 조직손상, 산화성 스트레스 등에 따라 유리되는 여러 종류의 cytokine에 의해서 유전자 전사단계에서 유도되며, 이에 따라 NO가 대량 생성 유리될 경우에는 질병의 병태생리에 중요한 인자로 관여할 수 있다 (30). COX-2는 염증 반응뿐만 아니라 혈액응고, 신장기능, 혈관조절 및 면역 반응 등에 관여하고, 염증성 cytokine이 분비되면 COX-2가 활성화 된다(31). 또한 COX-2는 염증조 직, 악성 종양조직에서 정상 세포에 비해 많은 양의 프로스 타글란딘의 생성을 유도하여 혈관 생성을 촉진하고 세포의 증식을 도울 뿐 아니라 면역능력을 억제함으로써 암세포 성장에 좋은 환경을 제공하여 COX-2의 발현은 또 다른 질병의 병원성과 직접적인 연관성을 나타낸다(32).

건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 확인한 결과(Fig. 8), iNOS 단백질 발현은 25, 50, 100 μg/mL에서 모두 감소하였다. 또한 생잎 추출물 농도 100 μg/mL에서는 LPS무처리군의 iNOS 발현 량과 비슷한 수준의 감소효과를 보였다. COX-2 단백질 발 현은 건조잎의 활성이 낮았으며, 생잎 추출물 농도 25, 50, 100 μg/mL에서 모두 높은 감소효과를 보였다. 건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물의 iNOS 및 COX-2 mRNA 수준을 확인한 결과(Fig. 9), iNOS mRNA 수준은 25, 50, 100 μg/mL에서 모두 감소하였다. 하지만 생잎 추출물 농도 25 μg/mL에서는 LPS 처리군의 iNOS 발현량과 비슷한 수준 으로 iNOS mRNA의 감소효과를 나타내지 않았다. COX-2 mRNA 수준이 발현은 건조잎의 활성이 낮았으며, 생잎 추 출물 농도 50, 100 μg/mL에서 높은 감소효과를 보였다. 건조 잎 추출물 농도 25, 50 μg/mL는 COX-2 mRNA의 발현저해 효과가 없었다. 결론적으로 염증 바생과 관련이 깊은 iNOS 및 COX-2 인자의 단백질 발현 및 mRNA 수준의 경감효과 가 상당하였으며 생잎의 활성이 건조잎의 활성보다 높았 다.

Fig. 8. Inhibitory effects of fresh and air -dr ied Abeliophyllum distichum Nakai leaves on the expression of iNOS and COX-2 protein. RAW 264.7 macropahges were stimulated with treatments of Lipopolysaccharide (LPS), air-dried and fresh leaves (0, 25, 50, 100 μg/mL) for 24 h. After 24 h stimulation, total cell lysates were subjected to Western blotting analysis. The protein expression of iNOS and COX-2 was detected by using an enhanced chemiluminescence reagent. Those levels were quantified by analysis with the software Un-SCAN-IT gel Version 5.1 (Silk Scientific, Inc.) and normalized to corresponding β-actin levels. Comparing with non-treated group (^#p<0.05), LPS-treated group (^*p<0.05). All data are from one experiment, representing three independent experiments.

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Fig. 9. Inhibitory effects of Abeliophyllum distichum Nakai leaves on the mRNA levels of iNOS and COX-2. RAW 264.7 macropahges were stimulated with treatments of Lipopolysaccharide (LPS), air-dried and fresh leaves (0, 25, 50, 100 μg/mL) for 6 h. After 6 h stimulation, total cell lysates were subjected to RT-PCR analysis. The mRNA levels of iNOS and COX-2 was detected by DNA electrophoresis. Those levels were quantified by analysis with the software Un-SCAN-IT gel Version 5.1 (Silk Scientific, Inc.) and normalized to corresponding GAPDH levels. Comparing with non-treated group (^#p<0.05), LPS-treated group (^*p<0.05). All data are from one experiment, representing three independent experiments.

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본 연구에서 건조 방식에 따른 미선나무 잎 물 추출물은 LPS로 활성화된 대식세포의 NO생성을 억제하는 것을 확 인하였다. 또한 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 및 mRNA 수준의 저해효과를 확인하였으며, 이러한 효과는 페놀화합 물뿐만 아니라 미선나무가 포함하고 있는 acteoside의 함량 에 직간접적인 상관관계가 있다고 사료된다. 이를 통해 건 조 방식에 따라 미선나무 잎의 항염증 및 항산화 활성 변화 를 확인하였다.