제주 황칠나무의 활용성 제고를 위한 부위별, 수확시기별, 추출용매별 quercetin 함량 분석

본 실험에서 사용한 황칠나무 추출물은 다음 추출조건에 의해 추출, 동결건조 분말화한 것을 한국식품정보원(Daejeon, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. 제주시 및 서귀포시에서 채취한 황칠나무는 5년생, 8년생, 10년생, 및 15년생으로 수령을 구분하고, 채취 시기는 5월, 8월 및 11월로 나누었으며, 채취 부위는 열매, 새싹, 성숙잎, 잔가지, 줄기로 구분하였다. 각 시료는 2 cm 내외로 세절한 후 50℃에서 15시간 열풍건조를 실시하고 각 시료에 10배수의 추출용매로 열수(80℃, 3 h), 30% 주정(75℃, 4 h) 및 60% 주정(70℃, 4 h)으로 추출하였다.

표준품으로서 quercetin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 MeOH로 용해시킨 후 1,000 μg/mL의 농도가 되도록 표준원액으로 제조하였다. 이를 50% MeOH로 희석하여 5, 10, 25, 50, 및 100 μg/mL 농도가 되도록 제조한 후 0.45 μm PVDF membrane filter(Millipore, Milford, MA, USA)로 여과한 뒤 표준용액으로 사용하였다. 표준용액의 크로마토그램에서 얻은 피크의 농도별 면적을 이용하여 작성한 표준검량선으로부터 quercetin 함량을 구하였다.

황칠나무 추출물의 quercetin 분석은 시료를 산 가수분해 처리하여 분석하였으며, Crozier 등(13)의 방법을 변형하여 실시하였다. 시료 분말 0.1 g을 정밀히 취하여 5% H₂SO₄이 포함된 50% MeOH 3 mL를 가하고 90℃에서 30분간 산가수분해를 실시하였다. 가수분해가 종료된 용액을 25 mL 정용플라스크에 50% MeOH로 정용한 뒤 0.45 μm syringe filter(Whatman Co., Morris, NJ, USA)로 여과한 용액을 시험용액으로 사용하였다.

황칠나무 추출물의 quercetin 분석은 Table 1에 요약되어 있다. HPLC 장비는 1525 Binary pump, column oven 및 2998 photodiode array detector(Waters HPLC system, Millford, MA, USA)를 사용하였고, 데이터 수집 및 처리를 위해 Empower3 software program(Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 사용하여 피크면적을 구하였다. 분석용 컬럼은 PhenoSphere^TM ODS(2) column(4.6×250 mm, 5 μm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 사용하였으며, 이동상으로는 trifluoroacetic acid(TFA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)가 함유된 용매로 용매 A(0.1% TFA 함유 water), 용매 B(0.1% TFA 함유 acetonitrile)를 사용하였고, 1.0 mL/min의 유속으로 분석을 실시하였다. UV는 370 nm 파장에서 측정하였고, 시료 주입량은 20 μL를 사용하였다.

지표성분의 HPLC 분석법 검증은 의약품 등 시험방법 밸리데이션에 대한 가이드라인(14,15)을 근거하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision)등을 수행하였으며, 직선성 검증으로부터 얻어진 검량선의 기울기와 표준편차를 이용해 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)를 확인하였다. 유효성 검증은 하나의 균질화된 시료(10년생, 5월 채취한 황칠나무 잎의 60% 주정추출물)로 실시하였다.

특이성(specificity) 검증은 quercetin 표준용액과 전처리한 시료용액을 HPLC로 분석한 후 크로마토그램을 비교하여 quercetin peak의 분리도 및 머무름 시간을 확인하였으며 photo diode array(PDA) spectrum을 측정하여 동일한 spectrum을 나타내는지 확인하였다.

직선성, 검출한계 및 정량한계(linearity, LOD and LOQ)는 단계적으로 희석한 quercetin 표준용액을 HPLC로 분석하여 3회 반복 측정하였으며 peak 면적비에 대한 농도비의 관계를 나타내는 표준검량선을 작성하였다. 검출한계와 정량한계는 표준용액의 크로마토그램을 이용하여 얻어진 검량선의 기울기와 표준편차에 근거하여 계산하였다.

정확성(accuracy)을 확인하기 위해 표준용액 10, 25, 및 50 μg/mL를 시료에 첨가하여 회수율을 구하였다. 각 시험은 3회 반복 HPLC로 분석하여 결과값이 참값에 근접한지 분석에 의해 회수되는 양을 백분률로 환산하였다.

정밀성(precision)을 확인하기 위해 전처리법에 따라 처리된 시험용액을 일내분석(intra-day)과 일간분석(inter-day)으로 나누어 진행하였다. Intra-day는 1일 3구간 6시간마다(9:00 AM, 3:00 PM, 9:00 PM)진행하였으며 각 3회씩 반복하여 HPLC로 분석하였고, inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였다. 각 시험은 구간마다 3회 반복하여 분석하여 정밀성를 나타내는 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 구하였다.

한국식품정보원으로부터 분양받은 황칠나무 추출물은 전처리법에 따라 처리 후 0.45 μm syringe filter로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 각 시료는 3회 반복하여 HPLC로 분석하였으며, 표준용액의 피크 면적을 통해 작성된 표준검량선을 이용하여 시험용액의 quercetin 농도를 산출하였다.

특이성 시험을 통해 quercetin 표준용액과 시험용액의 크로마토그램을 비교하여 다른 물질과의 간섭 없이 표준물질의 peak가 분리되는지 확인하였다. 표준용액과 황칠나무 추출물을 비교한 결과, 약 11분대에서 quercetin peak가 동일하게 검출됨을 확인하였고, 시험용액에서 다른 peak와 간섭 없이 완전히 분리됨을 확인할 수 있었다. 또한 표준용액과 시료용액의 PDA spectrum도 동일한 패턴을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

Fig. 1. HPLC chromatogram and PDA spectrum of (A) Blank, (B) quercetin standard and (C) Jeju Dendropanax morbifera Lev. extract at 370 nm by a photodiode array detector.

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표준품 quercetin을 5, 10, 25, 50, 및 100 μg/mL의 농도로 단계적으로 희석한 뒤 HPLC로 분석하여 표준검량선을 작성하였다. 검량선의 결정계수(R²)는 0.9996으로 높은 직선성을 보였으며, 검출한계는 0.28 μg/mL, 정량한계는 0.85 μg/mL이었다. 이 결과는 시료에 적용할 경우 검출한계는 0.28 μg/mL 수준으로 검출이 가능하고, 정량한계는 0.85 μg/mL 수준까지 정량할 수 있는 최저 농도를 의미한다.

지표성분을 농도별 시험용액으로 조제하여 HPLC 분석에 의해 회수되는 양을 확인하였다. Table 2에 나타난 바와 같이 quercetin의 회수율은 10 μg/mL의 농도에서는 104.10%, 25 μg/mL 농도에서는 97.91%, 50 μg/mL 농도에서는 98.37% 범위의 회수율을 보였다. Hu 등(16)은 quercetin 분석방법 검증에서 97.1-105.4%의 회수율을 보였으며, Wang과 Helliwell(17)은 녹차, 홍차잎, 녹차물에서의 quercetin 분석을 통해 102%의 회수율을 얻어 본 연구결과와 유사한 결과를 나타내어 본 시험법의 정확성을 확인할 수 있었다.

분석오차를 의미하는 정밀성은 균일한 하나의 시료로부터 여러번 반복 채취하여 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성을 의미하며, Table 2와 같이 intra-day와 inter-day로 나누어 상대표준편차(RSD)를 측정하였다. Intra-day 분석에서의 정밀도는 1.36-2.98%이었으며, inter-day분석에서의 정밀도는 2.11-3.65%이었다. 이상의 분석결과, 황칠나무 추출물의 조건별 quercetin 함량 분석의 유효성을 검증하였다.

본 연구에서는 제주산 황칠나무를 부위, 수확시기 및 추출용매별로 나누어진 시료에 대하여 표준화한 분석법으로 quercetin 함량을 비교 분석하여 Table 3과 같이 나타내었다. 열매를 제외한 quercertin 함량은 0.31-20.14 mg/g의 범위로 함량 차이가 많이 났으며, 가지 부위보다는 잎 부위에서 높은 함량으로 나타났다. 각 시료들의 함량차이는 각각 부위별로 나누어서 각 부위에서 가장 낮게 측정된 함량값을 기준으로 통계 분석을 실시하여 표시하였다. 각 부위별로 채취 시기별, 년생별, 추출방법별 심층 분석을 실시한 결과, 새싹 부위는 10년생을 제외하고 8년생과 15년생을 5월에 채취한 새싹 부위 추출물이 유의적으로 높은 함량을 보였다(p<0.001). 성숙잎 부위를 추출용매별로 함량차이를 비교한 결과 열수추출물보다 주정 함량이 높아질수록 quercetin 함량이 증가되는 것을 볼 수 있었으며, 특히 5월에 채취한 10년생 성숙잎의 경우 열수 추출물이 5.89 mg/g, 30% 주정 추출물이 18.06 mg/g, 60% 주정 추출물이 20.14 mg/g으로 주정 함량이 높아지는 추출방법일수록 quercetin함량이 유의적으로 증가되는 것을 볼 수 있었다(p<0.001). 성숙잎 부위를 계절별로 함량차이를 비교한 결과 10년생과 15년생 성숙잎의 모든 추출물에서 5월에 채취한 성숙잎의 quercetin 함량이 높은 것을 볼 수 있었으나, 8년생의 경우에는 11월에 채취한 추출물이 미약하게 quercetin함량이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 성숙잎을 년생별로 함량차리를 비교한 결과 5월을 기준으로 비교하면 8년생은 비교적 낮은 quercetin함량을 보였으나, 10년생 열수 추출물을 제외하고 10년생과 15년생의 모든 추출물은 서로 비슷한 수준의 높은 quercetin 함량을 볼 수 있었다.

잔가지 부위는 다른 부위에 비해 상대적으로 낮은 수준의 quercetin 함량을 보이고 있어 잔가지 부위에서의 함량 비교는 큰 의미가 없는 수준의 함량이나, 그 중에서 8년생의 11월에 채취한 추출물이 다소 높은 quercetin 함량을 볼 수 있었다(p<0.05). 줄기 부위 또한 다른 부위에 비해 상대적으로 낮은 수준의 quercetin 함량을 보이고 있으며 추출용매의 차이도 크지 않는 것으로 측정되었다(p>0.05). Hyun 등(8)은 황칠나무 quercetin 함량을 성숙잎은 0.0267 mg/g으로 보고하였으며 이는 재배환경, 추출방법 및 가수분해 유무 등의 차이에 의한 것으로 생각된다.

이상의 분석결과, 10년 이상 성숙한 황칠나무의 잎이 quercetin의 함량이 가장 높았으며 5월에 채취하여 주정을 포함한 추출용매를 사용하면 가장 높은 quercetin함량을 갖는 추출물을 제조할 수 있는 시기와 추출방법이라 사료된다. 또한 본 연구결과를 활용하면 제품의 원료로 사용된 황칠나무로서 추출 부위, 수확시기 및 년생을 추적할 수 있는 품질관리 기준으로의 적용도 가능할 것으로 사료된다.