들깨박단백질로부터 가수분해물과 한외여과 펩타이드 생산을 위한 효소가수분해 조건 및 항산화 활성

본 실험에 사용된 들깨(Perilla frutescens var. japonica HARA)박은 전라남도 해남군 화산면에서 재배된 국내산 들깨를 냉압착 방식으로 착유하고 남은 부산물로 Queensbucket(Seoul, Korea)으로부터 제공받았다. 들깨박은 이물질을 제거하고 마쇄한 후 체질하여 -40℃ deep freezer(MDF, Sanyo, Tokyo, Japan)에 보관하면서 실험에 사용하였다. 들깨박 단백질을 가수분해하기 위하여 사용한 단백질가수분해 효소인 pepsin, trypsin 및 papain은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, acalase, protamex, neutrase 및 flavourzyme은 Novo사(Nordisk Co., Bagvaerd, Denmark) 제품을 사용하였다.

들깨박으로부터 단백질을 추출하기 위해서 동결건조된 들깨박의 중량 대비 1:10(w/v)의 증류수를 넣어 25℃, 120 rpm의 shaking water bath(BS-11, JeioTech, Seoul, Korea)에서 60분간 교반하였다. 이 후 1 N NaOH를 적정량 주입하여 pH 10.0으로 일정하게 유지시켜 25℃에서 60분간 단백질을 용출시킨 후, 원심분리(Supra-21K, Hanil, Incheon, Korea)하여 상등액을 취하였다. 상등액에 1 N HCl 용액을 이용하여 pH 4.0로 조정하고 25℃에서 30분 동안 반응시켜 단백질을 침전시킨 후, 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 침전 단백질을 얻었다. 이때 얻어진 단백질 침전물을 중량대비 1:2(w/v)의 증류수를 가하여 homogenizer(AM-1, Nissei, Tokyo, Japan)로 충분히 균질화시킨 후 0.1 N NaOH을 이용하여 pH 7.0로 중화시킨 다음, 동결건조 시켜 효소가수분해물 제조를 위한 시료로 사용하였다.

효소활성 측정은 Anson(15)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 시험관에 buffer solution 1 mL를 가한 다음, 기질용액(0.6% casein, pH 7.0) 2.5 mL을 넣고 37℃로 incubation한 후 효소액 0.5 mL 넣고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 0.44 M trichloroacetic acid(TCA) 2.5 mL를 넣어 반응을 중지시키고 실온에서 10분간 방치한 다음 원심분리하였다. 이 후 상등액 1 mL에 0.55 M NaCO₃용액 5 mL와 1 N Folin & Ciocalteus reagent 1 mL 용액을 넣어 37℃에서 30분간 발색시켜 660 nm에서 흡광도(U-2900, Hitachi)를 측정하였다. 효소활성 단위는 pH 7.0, 37℃에서 casein(Sigma-Aldrich Co.)으로부터 1분 동안 1 μmol의 tryrosine을 유리시키는 효소의 양을 1 unit으로 하였다. 위의 방법에 따라 측정된 단백질가수분해효소의 활성은 pepsin 81.14 unit/mL, trypsin 314.51 unit/mL, papain 259.82 unit/mL, acalase 420.37 unit/mL, protamex 498.60 unit/mL, neutrase 562.69 unit/mL 및 flavourzyme 189.65 unit/mL이었다.

들깨박단백질의 가수분해를 위한 최적 효소를 선정하기 위하여 Xie 등(16)의 방법을 약간 변형하여 Table 1의 효소 최적 조건에 따라 효소 반응하였다. 즉, 들깨박단백질은 각 효소의 최적 buffer solution를 이용하여 1:20(w/v) 농도로 제조하였으며, 10 unit의 효소를 첨가하였다. 그 후 shaking incubator(BS-11, JeioTech)를 이용하여 각 효소의 최적 온도에서 일정한 시간 동안 교반한 후, 99℃에서 5분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 후 18,000 ×g에서 20분 동안 원심분리하여 얻어진 상등액의 가수분해도 측정하였다.

단백질가수분해물의 가수분해도는 가수분해물에 20% TCA를 동량 첨가하여 실온에서 30분 동안 방치시키고 원심분리한 다음 상등액을 일정량 취하여, bicinchoninic acid(BCA)법(17)에 준하여 10% TCA 가용성 단백질량을 측정한 후, 아래의 식을 이용하여 산출하였다.

들깨박단백질의 가수분해물을 제조하기 위하여 Xie 등(16)의 방법을 약간 변형하여 효소 최적 추출조건에 따라 가수분해하였다. 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 이용하여 5%(w/v) 농도로 제조된 들깨박단백질 용액 25 mL에 flavourzyme 10 unit를 첨가하여 50℃에서 4시간 동안 효소 반응시켰다. 이후 99℃에서 10분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 후 18,000 ×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 얻어진 상등액을 한외여과막(molecular weight cut-off 1, 3, 5, 10 kDa)을 사용하여 분자량 <1 kDa, 1-3 kDa, 3-5 kDa, 5-10 kDa, >10 kDa으로 분획하고 동결건조하여 각각의 수율 및 항산화 활성을 측정하였다.

한외여과에 의해 얻은 각 분획물의 수율은 동결건조한 후 중량법 따라 백분율로 표시하였으며, 다음과 같이 계산하였다.

1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능은 Jang 등(18)의 방법에 준하여 측정하였다. Microwell plate에 농도별로 제조한 각 들깨박단백질 가수분해물 100 μL를 취한 후 0.2 mM DPPH 용액 200 μL를 가하고, 37℃에서 30분간 incubation 후 microplate reader(EPOCH, BioTek Instrument Inc, Winooski, VT, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

환원력은 Mau 등(19)의 방법에 따라 측정하였다. e-Tube에 농도별로 제조한 시료 250 μL, 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6) 250 μL와 1% potassium ferricyanide(KFe(CN)₆) 250 μL을 첨가하여 잘 혼합하고 50℃에서 20분간 반응시켰다. 이 반응액에 10% trichloroacetic acid(CCl₃COOH) 250 μL를 첨가한 후 25℃, 1,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이 상등액 250 μL와 0.1% ferric chloride(FeCl₃·6H₂O) 50 μL를 반응시켜 microplate reader(EPOCH, BioTek Instrument Inc.)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 측정은 Bradford(20)의 방법에 따라 농도별로 제조한 시료 0.5 mL에 pH 8.5로 보정한 Tris-HCl buffer(50mM tris[hydroxymethyl] amino-methane+10 mM EDTA) 3 mL와 7.2 mM pylogallol 0.2 mL를 가하여 25℃에서 10분간 방치한 후 1 N HCl 0.1 mL로 반응을 정지시킨 후 spectrophotometer(U-2900, Hitachi)을 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 실험의 결과는 3반복으로 수행되었으며, 각 실험 결과에 대한 평균값과 표준편차를 나타내었다. 통계분석은 SPSS(Ver. 21, Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석법을 p<0.05 수준에서 실시하였으며, 실험의 평균치간의 유의적 차이는 Duncan’s multiple range test로 검증하였다. 또한 가수분해물의 효소반응시간에 따른 가수분해율의 유의차를 p<0.05 수준에서 t-test로 검증하였다.

들깨박단백질로부터의 가수분해물을 생산하기 위한 효소를 선정하기 위해 7종의 단백질분해효소를 이용하여 효소 반응시킨 후 이들의 가수분해도를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 각 효소 종류에 따른 들깨박단백질의 가수분해도는 2시간일 때는 flavourzyme 66.60%, protamex 55.57%, papain 53.49%, pepsin 49.91%, trypsin 49.87%, acalase 47.97%, neutrase 42.60%로 나타났다. 4시간의 경우는 flavourzyme 70.68%, protamex 56.43%, papain 56.08%, trypsin 55.75%, acalase 52.37%, pepsin 51.04%, neutrase 43.89%의 가수분해도가 나타나, 2시간 반응에 비해 유의적으로 높은 가수분해도를 나타내었다. 들깨박단백질 가수분해도는 단백질분해효소 중에서 flavourzyme이 가장 높았는데, Yoon 등(21)은 flavourzyme은 exo형과 endo형을 동시에 가수분해할 수 있는 단백질분해효소이기 때문인 것으로 추정하였다. 또한, 2시간 반응의 경우 가수분해도는 flavourzyme 다음으로 protamex, papain, trypsin, pepsin 순으로 높게 나타났다. 이 중 protamex의 경우는 2시간 반응에서 가수분해도는 55.57%로 flavourzyme 다음으로 높았지만, 4시간 반응에서는 56.43%에 불과하여 다른 효소에 비해 반응시간 증가에 따른 가수분해도의 증가가 상대적으로 낮았다. 이는 같은 기질에서도 효소 종류에 따라 가수분해도 차이가 있으며 단백질의 구조적인 민감성과 효소의 특이 기질에 대한 반응성의 차에 기인한 것으로 판단된다(22). 또한, 반응시간에 따른 유의적인 차이는 나타났지만 반응시간이 길어짐에 따라 가수분해도가 완만하게 증가하였는데, Kim(22)은 효소 첨가 시 반응초기에는 반응성이 좋은 펩타이드 결합이 우선적으로 분해되고, 반응성이 약한 펩타이드 결합은 천천히 분해되기 때문으로 보고하였다. 또한 일정 반응 후에 일정한 분해도를 유지하는 것은 가수분해 생성물이 가수분해 속도를 저해하기 때문으로 보고하였다. 이상의 결과에서 들깨박단백질 가수분해물 제조를 위한 효소는 가수분해도가 가장 높은 flavourzyme으로 선정하였다.

Fig. 1. Degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysates from perilla seed meal protein. The bar represents the mean and SD (n=3). Values with different letters in the same hydrolysis time are significantly different at p<0.05. ^*Significant difference between 2 h and 4 h by the Student’s t-test (p<0.05).

Download Original Figure

들깨박단백질 효소가수분해물 생산을 위한 최적 분해조건을 설정하기 위하여 pH, 온도, 효소농도에 따른 가수분해물의 가수분해도를 측정하였으며, 그 결과를 Table 2에 나타내었다. 가수분해물의 가수분해도는 pH 7.0에서 70.50%으로 유의적으로 가장 높았으며(p<0.05), pH 4.0에서 pH 7.0까지는 가수분해도가 유의적으로 증가하였다. 그 이후에는 가수분해도가 감소하여 pH 9.0에서는 28.29%로 가장 낮은 가수분해도를 보였다. Beak 등(23)의 연구에서는 홍게자숙부산물의 가수분해물이 pH 7.45에서 가수분해도가 가장 높아 본 연구 결과와 유사하였다. 따라서 들깨박단백질로부터 가수분해물 생산을 위한 flavourzyme의 최적 pH는 7.0으로 선정하였다. 최적 pH 7.0에서 온도에 따른 가수분해물의 가수분해도를 측정한 결과, 50℃에서 69.31%로 유의적으로 가장 높았으며(p<0.05), 30℃에서 59.11%으로 가장 낮은 값을 나타내었다. Jang 등(24)의 연구에서는 홍게 가공부산물로부터 단백질 가수분해물을 얻기 위해 flavourzyme을 이용하여 가수분해도를 측정한 결과, 50℃에서 가장 높은 분해도를 나타내 본 연구 결과와 일치하였다. 따라서, 들깨박단백질로부터 가수분해물 생산을 위한 flavourzyme의 최적 온도는 50℃로 결정하였다. 최적 pH 7.0, 50℃에서 효소농도에 따른 가수분해물의 가수분해도를 측정한 결과, 5 unit에서 44.78%으로 유의적으로 가장 낮았으며, 10 unit에서 67.68%로 유의적으로 가장 높게 나타났다(p<0.05). 그 후에는 가수분해도가 감소하였는데, 이는 효소가 반응할 수 있는 기질의 양이 부족하기 때문으로 사료된다. 따라서 들깨박단백질로부터 가수분해물 생산을 위한 flavourzyme의 최적 효소농도는 10 unit으로 결정하였다. 이상의 결과에 따라 flavourzyme를 이용한 들깨박단백질 가수분해물 생산을 위한 최적 분해 조건은 pH 7.0, 50℃, 효소농도 10 unit, 가수분해시간은 4시간으로 설정하였으며, 이 때의 가수분해도는 69.16%였다. 본 연구결과에서 얻은 들깨박단백질 가수분해 최적조건은 Table 1에서 제시된 flavourzyme의 최적 pH 및 온도와 일치함을 알 수 있었으며, 최적조건 하에서 효소분해 반응속도가 증가함에 따라 가수분해도가 높아진 것으로 판단된다.

가수분해도가 가장 높은 flavourzyme 가수분해물을 한외여과장치를 이용하여 분자량 >10 kDa, 5-10 kDa, 3-5 kDa, 1-3 kDa, <1 kDa으로 분획한 후 동결건조 하여 측정한 수율을 Table 3에 나타내었다. 가수분해물 분획물 5가지 중에서 1 kDa 이하의 분획이 45.65%로 유의적으로 가장 높은 수율을 보였다(p<0.05). 이는 효소 작용으로 인해 고분자의 단백질이 수용성의 저분자 펩타이드로 가수분해되어 수율이 높아진 것으로 판단된다. 또한, >10 kDa 분획과 5-10 kDa 분획은 각각 16.37%와 16.45%로 비슷한 수율을 보였으며, 3-5 kDa 분획과 1-3 kDa 분획은 각각 10.67%, 10.86%으로 낮은 수율을 나타내었다. You 등(25)의 연구에서 담수어류인 미꾸라지 단백질 가수분해물의 분자량별 수율을 측정한 결과, 1 kDa 이하 분획의 수율이 40.23%으로 가장 높았다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 그러나 Yang과 Hong(26)의 연구에서는 10 kDa 이상의 수율이 가장 높은 것으로 나타나 본 연구 결과와 상이하였는데, 이는 사용된 기질, 효소, 반응시간 및 효소농도의 차이로 판단된다.

항산화 반응은 항산화 물질이 유리 라디칼과 수산기(-OH)가 결합하여 라디칼 생성 및 반응을 종결시켜주는 역할로 생체막의 활성산소 및 지질 과산화 라디칼에 의한 지질과산화 반응의 연쇄반응을 정지시킨다. 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) 라디칼은 짙은 자색의 안정한 라디칼로 항산화물질과 반응하여 탈색되어 노란색을 띄게 된다. 이러한 원리를 이용하여 항산화 물질의 수소공여능을 측정하였다(27). 들깨박단백질의 효소가수분해물 및 한외여과공정을 통해 얻은 분획물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 그 결과는 Fig. 2A에서 보는 바와 같이 효소가수분해물의 IC₅₀ 값이 0.58 mg/mL로 유의적으로 가장 낮아 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 다음으로 10 kDa 이상의 분획이 0.67 mg/mL, 3-5 kDa 분획이 0.79 mg/mL의 IC₅₀ 값을 나타내었다. 1 kDa 이하의 분획은 2.11 mg/mL로 유의적으로 가장 높은 IC₅₀ 값을 DPPH 라디칼 소거능이 가장 낮음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Bamdad와 Chen(28)이 보리단백질 효소가수분해의 라디칼 소거능은 10 kDa 이상에서 가장 높은 활성을 보였다고 보고한 연구 결과와 유사하였다. 또한 양송이버섯 단백질 가수분해물로부터 한외여과에 의해 분획된 펩타이드의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, <1 kDa과 3-5 kDa 펩타이드 분획이 단백질 가수분해물에 비해 낮은 소거능을 보였으며, acalase와 flavourzyme을 이용하여 얻은 가수분해물의 5-10 kDa 분획물이 가장 높은 라디칼 소거능을 나타낸 연구 결과(29)와 유사하였다. 이러한 결과는 효소가수분해물과 5-10 kDa의 한외여과 분획물은 전자공여능을 가지고 있는 펩타이드 또는 아미노산을 함유하고 있어 DPPH 라디칼을 안정화시키고 라디칼 연쇄반응을 차단할 수 있기 때문으로 판단된다. 반면, 닭뼈에서 용출된 펩타이드를 한외여과를 통해 얻은 3 kDa 이하 분획이 3-10 kDa 분획에 비해 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보여(30) 본 연구 결과와 차이가 있었다. Collupulin MG를 이용하여 도루묵으로부터 얻은 효소가수분해물과 한외여과 펩타이드의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과(18), 1.0 mg/mL 농도에서 8-24%의 라디칼 소거능을 가지고 있어 본 연구에서 얻은 들깨박단백질의 DPPH 라디칼 소거능이 우수함을 알 수 있었다. 또한 3 kDa 이하의 펩타이드 분획의 라디칼 소거능이 가장 우수하였으며, 그 다음 10 kDa 이상의 펩타이드 분획이 두 번째로 높은 라디칼 소거능을 보여(18), 본 연구 결과와 다소 차이를 보였다. 이러한 차이는 DPPH 라디칼 소거능은 효소의 특이성, 펩타이드의 분자량, 아미노산의 종류 및 배열에 따라 그 활성에 차이를 보이기 때문으로 판단된다(3).

Fig. 2. Antioxidant activity of the enzymatic hydrolysate and peptides obtained from perilla seed meal protein. A, DPPH radical scavenging activity; B, Reducing power; C, SOD-like activity. The bar represents the mean and standard deviation (n=3). Values with different letters are significantly different at p<0.05.

Download Original Figure

들깨박단백질의 효소가수분해물 및 이들 분획물의 환원력을 측정한 결과(Fig. 2B), 3-5 kDa 분획이 136.42 μg/mL의 IC₅₀ 값으로 유의적으로 가장 높은 환원력을 나타내었으며, 10 kDa 이상 분획이 150.59 μg/mL의 IC₅₀ 값으로 두 번째로 높은 환원력을 나타내었다. 반면, 1 kDa 이하의 분획이 564.16 μg/mL로 가장 높은 IC₅₀ 값을 나타내어 환원력이 가장 낮음을 알 수 있었다. 닭뼈 추출물을 한외여과하여 얻은 펩타이드 분획의 환원력을 측정한 결과, 2 mg/mL 농도에서 0.08-0.18의 환원력을 보였으며, 저분자 펩타이드 분획(3 kDa 이하)이 고분자 펩타이드 분획(3-10 kDa)에 비해 높은 환원력을 보여(30) 본 연구결과와 다소 차이를 보였다. 양송이버섯 단백질을 flavourzyme과 alcalase를 비롯한 다양한 단백질가수분해효소를 이용하여 가수분해 후 한외여과를 통해 얻은 펩타이드의 환원력을 측정한 결과, 1 mg/mL 농도에서 약 0.1-0.2의 환원력을 나타내어 본 연구에서 얻은 단백질 분획물의 환원력이 매우 높음을 알 수 있었다(29). 또한 flavourzyme을 이용하여 얻은 가수분해물 및 한외여과 분획물의 환원력은 1 kDa이하가 가장 높은 반면, 10 kDa 이상 분획물의 환원력이 가장 낮게 나타나(29) 본 연구결과와 차이가 있었다.

세포의 호흡작용에 의해 생성되는 활성산소종은 세포막에 작용하여 세포 손상, DNA 및 단백질에 영향을 주어 노화를 촉진시킨다. Superoxide는 산소가 전자 하나를 받아 환원된 형태로 체내 산화적 손상을 야기할 수 있으며, SOD는 2O₂^-+2H⁺→H₂O₂+O₂와 같은 반응으로 활성산소로부터 세포를 보호한다. SOD 유사물질이란 SOD와 같이 superoxide를 정상의 산소로 전환시킬 수는 없으나 superoxide의 반응성을 억제하여 생체를 산화적 손상으로부터 보호할 수 있는 저분자 물질을 의미한다(31). 따라서 SOD 유사활성은 중성이나 알칼리 조건 하에서 superoxide에 의해 pyrogallol이 자동산화 되면서 갈색물질을 생성하는 원리를 이용하여 자동산화를 억제하는 정도로 활성을 측정하였다(32). 들깨박단백질의 효소가수분해물 및 이들 분획물의 SOD 유사활성을 측정한 결과는 Fig. 2C에 나타내었으며, 1 kDa 이하 분획물이 가장 낮은 IC₅₀ 값(2.68 mg/mL)을 나타내었다. 1-3 kDa, 3-5 kDa, 5-10 kDa 및 10 이상 분획의 IC₅₀ 값은 각각 3.13, 4.28, 5.02 및 5.41 mg/mL로 측정되어 분자량이 작을수록 SOD 유사활성은 커지는 것으로 나타났다. 또한 단백질 효소가수분해물의 IC₅₀ 값은 4.98 mg/mL로 분획 중 중간 정도의 활성을 보였다. 이상의 결과 들깨박단백질 효소가수분해물 중 저분자 분획물이 높은 SOD 유사활성을 가져 섭취 시 인체 내 superoxide를 제거하고 산화적 노화를 억제하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.