쌀의 품종에 따른 미강 추출물의 이화학적 품질특성 및 항산화 활성모니터링

본 연구에 사용한 미강의 품종은 3종(Bukkyeong 2012-2(북경), Jasmin 85(자스민) 및 한아름)으로 2017년 수확하여 정미기(LH-5000M, Hwangso Co., Daegu, Korea)로 10분도로 정미한 후 얻어진 미강을 국립식량과학원으로부터 제공받아 사용하였다. 미강은 분쇄기(RT-04, Hanli Co., Sejong, Korea)로 분쇄하여 60 mesh 표준망체(Chung Gye Sang Cong Sa, Seoul, Korea)를 통과한 분말을 -20℃ 이하 암소에서 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.

미강 분말의 수분함량은 시료 0.5 g을 petridish에 담아 적외선 수분측정기(MB-45, Mositure analyzer, INC., Ohaus, NJ, USA)를 이용하여 105℃에서 분말의 수분함량이 항량에 도달할 때까지 건조하여 측정하였다. 색도는 표준색도 Y=86.6, x=0.3160, y=0.3214로 보정된 chromameter(CR-400, Minolta Co., Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였으며, L 값(brightness), a 값(redness-greenness), b 값(yellowness-blueness)을 3회 반복 측정하여 평균치로 나타내었다.

미강 분말 10 g에 10배의 용매(증류수, 80% 에탄올 및 80% 메탄올)를 가한 다음 환류냉각추출기(CA-1112, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 각각 100℃ 및 80℃에서 4시간 추출하였다. 추출 후, 불순물을 제거하기 위하여 여과지(No.2, Whatman International Ltd., Leicestershire, UK)를 이용하여 여과하였다. 여과된 용액은 감압농축기(Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 다음, 동결건조기(Free Zone 2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)로 건조하여 -70℃ 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.

추출용매에 따른 추출물의 수율은 동결건조(Free Zone 2.5, Labconco Co.)한 다음 건물 중량을 구하였고 시료 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(20)에 따라 시료 1 mL에 1 N Folin Ciocalteu reagent 1 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 다음 20% Na₂CO₃ 1 mL를 첨가하여 실온의 암소에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 Jia 등(21)의 방법을 응용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 5% NaNO₂ 150 μL를 혼합하여 실온에서 6분간 반응 시킨 후 10% AlCl₃ 300 μL와 혼합하여 다시 실온에서 5분간 반응 시킨 후 1 N NaOH 1 mL와 혼합한 다음 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드함량은 rutin(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

총 단백질 함량은 Lowry 등(22)의 방법으로 측정하였다. 실험 전, A(Na₂CO₃ 5 g을 0.5 N NaOH 50 mL 용해), B(CuSO₄·5 H₂O 0.2 g을 증류수 20 mL 용해) 및 C(potassium tartarate 0.4 g을 증류수 20 mL 용해)를 각각 제조한 다음 이를 혼합하여 D(A: 30 mL, B: 1.5 mL 및 C: 1.5 mL)를 제조하였다. 그 후, E(2 N Folin-Ciocalteu 4.5 mL를 증류수 45 mL 용해)를 제조하여 준비하였다. 시료 1 mL에 D 1 mL 첨가 후, 15분간 실온에서 방치한 다음, E 3 mL 첨가하여 다시 45분간 실온에서 방치하고 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 단백질 함량은 bovine serum albumin(BSA, Sigma-Aldrich Co.)을 표준곡선으로 이용하여 계산하였다.

DPPH radical 소거활성은 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH)의 환원력을 이용하여 측정하였다(23). 즉, DPPH reagent는 DPPH 12 mg을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후 증류수 100 mL 첨가하여 흡광도를 517 nm에서 약 1.6으로 조정하여 제조하였다. 시료 0.5 mL에 DPPH reagent 5 mL를 혼합하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)로 흡광도를 측정하고 아래와 같이 계산하였다.

$\mathrm{D}\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{H}\mathrm{ }\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{ }\mathrm{s}\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{v}\mathrm{e}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{ }\mathrm{a}\mathrm{c}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{v}\mathrm{i}\mathrm{t}\mathrm{y}\left(\mathrm{\%}\right)=(1-\frac{\mathrm{S}}{\mathrm{C}})\times 100$

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) radical 소거활성(24)은 7.4 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium persulfate를 최종 농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되게 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 희석하였다. 희석된 용액 180 μL에 시료 20 μL를 혼합하여 정확히 1분간 반응시킨 다음 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

$\mathrm{A}\mathrm{B}\mathrm{T}\mathrm{S}\mathrm{ }\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{ }\mathrm{s}\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{v}\mathrm{e}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{ }\mathrm{a}\mathrm{c}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{v}\mathrm{i}\mathrm{t}\mathrm{y}\left(\mathrm{\%}\right)=(1-\frac{\mathrm{S}}{\mathrm{C}})\times 100$

FRAP는 Benzie와 Strain의 방법(25)에 따라 다음과 같이 측정하였다. FRAP reagent는 25 mL acetate buffer(300 mM, pH 3.6)를 37℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.) 2.5 mL와 20 mM ferric chloride(FeCl₃) 2.5 mL를 첨가하여 제조하였다. 시료 30 μL에 제조된 FRAP reagent 900 μL와 증류수 90 μL를 넣은 후 37℃에서 10분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP는 FeSO₄·7H₂O (Sigma-Aldrich Co.)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

환원력은 Oyaizu(26)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 시료 1 mL에 0.2 M phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 1% potassium ferricyanide(Duksan pure chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea) 용액 2.5 mL를 가한 후 50℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 10% trichloroacetic acid(Duksan pure chemicals Co.) 용액 2.5 mL를 가하여 원심분리한 후, 상등액 2.5 mL에 증류수 2.5 mL와 0.1% ferric chloride(Duksan pure chemicals Co.) 용액 0.5 mL를 혼합한 다음 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

모든 실험결과는 IBM SPSS Statistics(19.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용한 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의성(p<0.05)은 Duncan's multiple range test를 실시하여 검정하였다.

미강 3종(Bukkyeong 2012-2(북경), Jasmin 85(자스민) 및 한아름) 분말의 수분함량 및 색도는 Table 1과 같다. 수분함량은 북경, 한아름 및 자스민 미강 분말에서 각각 8.30%, 9.00% 및 8.19%로 한아름 미강 분말에서 가장 높게 나타났다.

색도는 L 값, a 값 및 b 값이 각각 50.06-55.18, 2.35-2.97 및 11.65-13.88로, 북경 미강 분말에서 L 값, a 값 및 b 값이 모두 높게 나타났으나, 미강 품종에 따른 색도차이는 크게 나타나지 않았다. Shin 등(27)의 볶은 미강을 첨가한 식빵의 품질특성에서 볶음 미강의 첨가량이 증가할수록 L 값은 감소하고 a 값 및 b 값이 증가한다고 보고하였으며, Lee 등(28)의 도정률에 따른 향미벼의 이화학적 품질특성에서 도정률이 증가할수록 L 값이 증가하고 a 및 b 값이 감소한다고 보고하여, 향후 미강 분말을 첨가한 제품은 첨가량에 따라 색도에 영향을 줄 것으로 판단된다.

추출용매 및 품종에 따른 미강 추출물의 수율, 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 단백질 함량은 Table 2와 같다. 수율은 4.67-9.60%로, 다른 추출물에 비해 한아름 추출물에서 높은 추출수율을 나타내었으며, 모든 시료에서 80% 에탄올 및 80% 메탄올 추출물보다 열수 추출물의 추출수율이 높게 나타났다. Jeon 등(29)의 미강 에탄올 추출물의 수율은 4.50%로 나타나 본 연구 결과와 유사하였으나 Jung 등(30)의 미강 추출물의 수율은 에틸아세테이트 추출물은 2.6%, 알칼리 분해 후 에틸에세테이트 추출물은 3%, 80% 메탄올 추출물은 1.35%로 나타나 본 연구에서의 북경, 자스민 및 한아름미의 미강 추출물의 수율이 높은 것으로 나타났다.

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 각각 2.08-6.75 g/100 g 및 4.08-5.18 g/100 g 으로 대체로 북경 추출물에서 높게 나타났으며, 모든 시료에서 열수 추출물보다 80% 에탄올 및 80% 메탄올 추출물에서 높은 함량을 나타내는 경향이었다. Jung 등(30)의 미강 페놀산 농축물의 특성 및 항산화 활성에서 에틸아세테이트, 80% 메탄올 및 알칼리 분해 추출법으로 시료를 제조하여 총 폴리페놀함량을 측정한 결과, 22.64-744.57 mg/100 g으로 본 연구의 추출물이 더 높은 함량을 나타내었으며, 곡류에 함유되어 있는 페놀 화합물들은 우수한 항산화력을 가진다고 알려져 있어(31) 폴리페놀 함량이 높은 시료에서 우수한 항산화 활성을 나타낼 것으로 판단된다.

또한 총 단백질 함량은 12.57-18.46 g/100 g으로, 북경 추출물에서 높게 나타났으며, 모든 시료에서 80% 에탄올 및 80% 메탄올 추출물보다 열수 추출물에서 높은 함량을 나타내었다. Kim 등(32)의 품종 및 도정도별 보릿가루의 이화학적 특성에서 도정도별 조단백질 함량은 도정도가 감소함에 따라 함량이 증가하는 경향을 나타내었다. 이는 미강 내 단백질 함량이 12-15% 정도 차지하고 있으며, 곡류의 단백질 등 여러 가지 영양성분과 섬유질이 배유 중심으로부터 바깥부분으로 증가하기 때문이라 판단된다(33,34).

추출용매 및 품종에 따른 미강 추출물의 DPPH 및 ABTS radical 소거활성은 Fig. 1 및 Fig. 2와 같다. DPPH radical 소거활성은 0.5-5.0 mg/mL 농도로 실험한 결과, 북경 추출물에서 12.44-95.94%, 한아름 추출물에서 10.90-88.08% 및 자스민 추출물에서 5.80-79.98%으로 나타났다. 5.0 mg/mL 농도에서 북경, 한아름 및 자스민 추출물 순으로 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었으며, 80% 에탄올 추출물에서 가장 높은 함량을 나타내었다. Oh 등(16)은 홍진주, 흑광 및 여러 품종의 미강 70% 에탄올 추출물 1 mg/mL 농도에서 DPPH radical 소거활성은 90%, 82.89% 및 9.91-34.58%로 가장 높게 나타났는데, 이는 본 연구에서 다른 추출용매보다 80% 에탄올 추출물에서 radical 소거활성이 높게 나타난 경향과 유사하게 나타났다. 또한 Lee 등(2)의 미강추출물의 항산화 활성 연구에서는 물과 에탄올 추출에 따른 연구에서는 물 추출물이 67.12% 및 71.15%로 나타났으며, 에탄올 추출물은 89.43% 및 92.38%로 나타나 에탄올 추출물의 radical 소거활성이 높아 본 연구와 유사하였다. Jeon 등(29)의 미강 에탄올 추출물의 연구에서는 125 μg/mL, 250 μg/mL에서 각각 70%, 90%의 소거능을 보여 높은 항산화력을 나타내었다.

Fig. 1. . DPPH radical scavenging activity of rice bran extracts prepared by different extraction solvents and cultivar. A, Bukkyeong 2012-2 rice bran extracts; B, Han-ahreum rice bran extracts; C, Jasmin 85 rice bran extracts. Means±SD (n=3) with different letters (a-l) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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Fig. 2. . ABTS radical scavenging activity of rice bran extracts prepared by different extraction solvents and cultivar. A, Bukkyeong 2012-2 rice bran extracts; B, Han-ahreum rice bran extracts; C, Jasmin 85 rice bran extracts. Means±SD (n=3) with different letters (a-l) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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ABTS radical 소거활성은 0.5-5.0 mg/mL 농도로 실험한 결과, 북경 추출물에서 18.91-96.47%, 한아름 추출물에서 22.21-95.91% 및 자스민 추출물에서 18.77-83.09%으로 나타났다. Jung 등(30)의 미강 페놀산 농축물의 연구의 경우, 알칼리 분해 후 에틸에세테이트 추출물의 ABTS radical 소거활성은 10 μg/mL 농도에서 98%의 활성을 나타내어높은 항산화성을 나타내었다. 또한 ABTS radical 소거활성은 DPPH radical 소거활성과 유사하게 5.0 mg/mL 농도에서 북경, 한아름 및 자스민 추출물 순으로 높은 radical 소거활성이 나타났다. Chun 등(35)은 도정분획별 쌀의 항산화 활성을 조사한 결과 쌀의 도정률이 감소할수록 항산화 활성이 증가한다고 보고하여 미강에는 항산화 물질이 함유되어 있는 것으로 판단된다. 또한 Park 등(8)의 미강 추출물의 항산능 연구에서는 DPPH radical 소거활성은 용매를 메탄올로 쓰기 때문에 수용성 용액을 용매로 사용하는 ABTS radical 소거활성보다 높게 나타날 경우 폴리페놀류와 같은 지용성 성분이 많은 것으로 해석할 수 있으며, 반대의 경우 항산화 활성이 지용성 물질보다 수용성 고분자 물질에 많이 존재하는 것으로 예측하였다. 본 실험의 경우는 ABTS 라디칼에 대한 항산화능이 상대적으로 높아 수용성 항산화물질이 더 많이 존재함을 추측할 수 있었다.

추출용매 및 품종에 따른 미강 추출물의 FRAP 활성 및 환원력은 Fig. 3 및 Fig. 4와 같다. FRAP 활성은 0.5-5.0 mg/mL 농도로 실험한 결과, 북경 추출물에서 0.12-1.39 mM, 한아름 추출물에서 0.12-1.33 mM 및 자스민 추출물에서 0.06-1.17 mM로 나타났다. FRAP 활성은 5.0 mg/mL 농도에서 북경 및 한아름 추출물은 유사한 활성을 나타내었으며, 자스민 추출물에서 낮은 활성을 나타내었다. Sim 등(36)의 연구에서 모든 혼합물 내 미강 함유량이 증가함에 따라 FRAP 활성 또한 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, Lee 등(6)이 보고한 미강의 항산화 활성에 대한 연구 결과와 유사한 것을 확인하였다.

Fig. 3. . FRAP(ferric reducing antioxidant power) activity of rice bran extracts prepared by different extraction solvents and cultivar. A, Bukkyeong 2012-2 rice bran extracts; B, Han-ahreum rice bran extracts; C, Jasmin 85 rice bran extracts. Means±SD (n=3) with different letters (a-k) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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Fig. 4. . Reducing power of rice bran extracts prepared by different extraction solvents and cultivar. A, Bukkyeong 2012-2 rice bran extracts; B, Han-ahreum rice bran extracts; C, Jasmin 85 rice bran extracts. Means±SD (n=3) with different letters (a-j) above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).

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환원력은 0.5-5.0 mg/mL 농도로 실험한 결과, 북경 추출물에서 0.23-1.97, 한아름 추출물에서 0.19-1.71 및 자스민 추출물에서 0.17-1.52로 나타났다. 5.0 mg/mL 농도에서 북경, 한아름 및 자스민 추출물 순으로 높은 환원력을 나타냈으며, 80% 에탄올 및 80% 메탄올에서 유사하게 나타났다. Oh 등(16)의 벼 품종별에 따른 항산화 효과 연구에서는 환원력을 측정하였을 때 미강 추출물의 경우 1 mg/mL 농도에서는 0.03-0.35로 나타나 본 연구 결과와 유사하였다. 또한 추출용매 및 품종에 따른 미강 추출물의 항산화 활성을 확인한 결과는 Chung 등(37)이 보고한 흑미 유래 페놀 화합물의 항산화 활성에서 높은 폴리페놀 함량을 나타내는 분획물은 항산화 활성 또한 우수함을 확인한 연구결과와 유사하게 나타났으며, 이는 80% 에탄올에 의해 추출된 폴리페놀 및 플라보노이드 성분이 주요 항산화 물질일 것으로 추정되며 좀 더 구체적인 성분 분석 등의 연구 진행이 필요하다.