3T3-L1 지방전구세포에서 1-O-feruloyl-β-D-glucose의 지방생성억제효과

세포 배양에 필요한 fetal bovine serum(FBS), penicillin, streptomycin, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)과 0.5% Trypsin-EDTA은 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. 세포 분화에 필요한 methylisobytylxanthine, dexamethasone, insulin과 지방세포 분화 및 지방구 축적 실험을 위한 Oil red O는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터, sodium pyruvate는 Gibco Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. Formaldehyde 용액은 JUNSEI chemical Co., Ltd.(Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 단백질 정량에 사용하는 Bio-Rad Protein Assay kit는 Bio-Rad Laboratories, Inc.(Hercues, CA, USA)에서 구입하였다. Western blotting에 사용된 1차 항체 anti-aP2/fatty acid binding protein(FABP) 4 rabbit polyclonal(#2120), anti-CCAAT/enhancer binding proteins(C/EBP)α(D56F10, #8178) rabbit monoclonal는 Cell Signaling TECHNOLOGY (Danvers, MA, USA)로부터, anti-peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γ(E-8, #sc-7273) mouse monoclonal은 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY(Dallas, TA, USA)로부터, anti-β-actin mouse monoclonal은 Novus Biologicals (Littleton, CO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

본 실험에 사용된 FG는 화살나무(귀전우(鬼箭羽), Euonymus alatus (Thunb.) Sieb)의 껍질로부터 Jeong 등에 의해 서술된 방법(8)으로 추출, 분리한 FG를 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다.

본 실험에 사용한 세포는 마우스 유래의 3T3-L1 지방전구세포로 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 세포는 10% FBS, 100 U/mL penicillin과 100 mg/mL streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 환경인 배양기에서 배양하였다.

3T3-L1 지방전구세포를 24-well plate에 5×10⁴ cells/mL/well의 세포수가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 세포가 well에 가득 찰 때까지 배양하였다(3일간). 그 후 분화용 배지(115 μg/mL methylisobytylxanthine, 1 μg/mL insulin, 1 μM dexamethasone, 10% FBS, 100 U/mL penicillin과 100 mg/mL streptomycin이 함유된 DMEM 배지)로 교환하여 2일 간격으로 새로운 배지로 교환하면서 6일 동안 배양하였다. 그 후 1 μg/mL insulin, 10% FBS, 100 U/mL penicillin과 100 mg/mL streptomycin이 함유된 DMEM 배지로 교환한 후 2일 간격으로 새 배지로 교환하면서 추가 배양하여 지방세포로 분화를 유도하였다. FG는 분화용 배지 및 1 μg/mL insulin을 포함한 배지에 농도별(0, 1, 2.5, 5 μM)로 첨가하여 세포에 처리하였다. 분화가 유도 되었는지는 현미경 관찰 및 Oil Red O염색을 통해서 확인하였다.

FG가 3T3-L1 지방전구세포의 증식에 미치는 영향을 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/200 μL/well의 세포수가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 18시간 배양하였다. FG를 농도별(0, 1, 2.5, 5 μM)로 처리한 후 48시간 동안 배양시켰다. 배양 후 CellTiter96^Ⓡ Aqueous One Solution Assay of Cell Proliferation(Promega, Madison, WI, USA)을 이용해 세포 증식능을 micro plate reader(Sunrise; Tecan, Austria)를 사용하여 측정하였다. 측정값은 FG를 처리하지 않은 0 μM FG군에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.

FG가 3T3-L1 지방전구세포의 증식에 미치는 영향을 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/200 μL/well의 세포수가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 18시간 배양하였다. FG를 농도별(0, 1, 2.5, 5 μM)로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 CytoTox96^Ⓡ Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)을 이용해 FG가 3T3-L1 세포에 대해 독성을 나타내는지를 micro plate reader(Sunrise; Tecan, Austria)를 사용하여 측정하였다.

분화가 종료되면 기존 배지를 제거하고 10% formaldehyde 용액을 1 mL 첨가하여 1시간 동안 세포를 고정시켰다. 2 mL의 60% isopropyl alcohol을 각 well에 첨가하여 세포를 세척하고 건조시켰다. Oil Red O 염색용액을 1 mL씩 각 well에 넣고 10분간 배양하였다. Oil Red O를 제거하고 증류수로 4번 세척한 후 건조하여 염색된 세포를 사진 촬영하였다. 100% isopropyl alcohol을 1 mL 넣어 세포에 염색된 Oil Red O를 용출시켰다. 이것을 96-well plate에 200 μL씩 담고, 490 nm에서 흡광도를 측정하여 3T3-L1 지방세포로의 분화에 따른 지질 방울(lipid droplet) 형성을 평가하였다.

3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화하는데 있어서 FG가 어떠한 미치는 영향을 미치는지를 평가하기 위해 세포로부터 총 단백질을 추출하여 지방생성관련 전사인자 및 관련 유전자의 단백질 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 분화용 배지로 분화 시킨 후 세포를 PBS로 세척하고 세포에 cell lysis buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM ethylenediamine tetra-acetic acid(EDTA), 50 mM sodium fluoride(NaF), 30 mM sodium pyrophosphate(Na4P2O7), 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 2 mg/mL aprotinin, 1 mM pervanadate)를 첨가하여 얼음에서 10분 동안 배양 한 후 12,000 ×g로 15분 동안 원심분리 하여 상층액을 얻었고, Bio-Rad Protein Assay kit를 사용하여 단백질을 정량하였다.

세포 총 용해물의 단백질 농도(10 μg protein/lane)가 동일하도록 조정한 후 2×sodium dodecyl sulfate(SDS) sample buffer를 가하고 100℃에서 5분간 끓여 열변성하였다. Mini-PROTEAN system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 10% SDS polyacrylamide gel을 만들어 각 well에 단백질 양이 동일하도록 각 시료를 loading 하고 전기영동을 시행하였으며 이어서 Immobilon^Ⓡ transfer membranes 0.45 μm(Millipore, Billerica, MA, USA)에 transfer시켰다. Membrane을 1×blocking buffer(Biofact Biofactory, Daejeon, Korea)로 실온에서 1시간 동안 blocking 한 후 일차항체 anti-FABP4(1:1,000), anti-PPARγ(1:200), anti-C/EBPα(1:1,000), anti-β-actin(1:10,000)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20(TBST, pH 8.0)로 세척한 다음 이차항체(HRP-conjugated anti-rabbit IgG(1:2,000), anti-mouse IgGκ(1:5,000), anti-mouse IgG(1:5,000)에 1시간 동안 실온에서 배양하였다. TBST로 세척하고 ECL solution(Thermo Scientific) 기질로 반응시킨 후 LAS-3000 Lumino Image Analyzer System(Fuji film, Tokyo, Japan)를 이용하여 밴드를 확인하였다.

실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 GraphPad Prism Verson 5.0 software(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 실험 결과는 mean±standard error of mean(SEM)으로 나타냈으며, 각 그룹간의 통계적 유의성을 one-way ANOVA를 통한 Dunnett test나 Tukey's test를 통해서 사후 검정하였다. p 값은 p<0.05를 통계적 유의차가 있다고 판단했다.

FG가 지방세포로의 분화 및 지방구 축적 억제효과가 3T3-L1 지방전구세포의 성장자체를 억제시킴으로서 나타나는 효과인지를 확인하기 위하여, FG를 농도별(0, 1, 2.5, 5 μM)로 48시간동안 3T3-L1 지방전구세포에 처리하여 세포 성장에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, 0 μM FG군에서의 흡광도는 0.98±0.02인 것에 비해 1 μM FG군은 0.87±0.06, 2.5 μM FG군은 0.89±0.05, 5 μM FG군은 0.87±0.07로, 5 μM 농도까지 3T3-L1 지방전구세포의 성장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(Fig. 2).

Fig. 2. . Effect of FG on cell proliferation in 3T3-L1 preadipocyte. 3T3-L1 cells were seeded in a 96-well plate and treated with various concentrations of FG (0, 1, 2.5, 5 μM). After 48h, cell proliferation were determined by the methods described in the Material and Methods section. The reseults are reported as the mean±SEM of three independent experiments (n=4). Statistical significance is based on the difference when compared with 0 μM FG.

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세포 성장과 더불어 FG가 3T3-L1 지방전구세포에 독성을 나타내는지를 평가하기 위하여 FG를 농도별(0, 1, 2.5, 5 μM)로 48시간동안 3T3-L1 지방전구세포에 처리하여 세포 성장에 미치는 영향을 측정한 결과, 0 μM FG군에서의 흡광도가 0.25±0.00인 것에 비해 5 μM FG군은 0.25±0.00으로 대조군에 비해 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다(Fig. 3). 이상의 결과로부터 FG가 3T3-L1 지방전구세포의 성장을 억제시키거나 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였으며, 따라서 이후의 모든 실험에서 0-5 μM의 농도로 FG를 처리하였다.

Fig. 3. . Effect of FG on cell cytotoxicity in 3T3-L1 preadipocyte. 3T3-L1 cells were seeded in a 96-well plate and treated with various concentrations of FG (0, 1, 2.5, 5 μM). After 48h, cell cytotoxicity were determined by the methods described in the Material and Methods section. The reseults are reported as the mean±SEM of three independent experiments (n=4). Statistical significance is based on the difference when compared with 0 μM FG.

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Oil red O 염색법은 지방이 Oil red O 용액에 의해 붉게 염색되는 것을 사진촬영이나 현미경 촬영을 통해 시각적으로 나타내거나 isoprophylalcohol로 염색된 지방을 추출하여 흡광도를 측정함으로써 3T3-L1 지방전구세포의 지방생성을 평가하는 방법이다(13). FG가 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방구 축적에 미치는 영향을 검토하기 위해서, FG를 농도별로 함유한 분화용 배지로 3T3-L1 지방전구세포를 12일간 배양하였다. 그 후 Oil red O 염색 용액을 이용하여 지방구를 염색하여 염색된 시약을 isopropyl alcohol로 용출하여 그 효능을 평가하였다. 그 결과, 분화 전 3T3-L1 지방전구세포의 Oil red O 염색용액에 의한 흡광도는 0.04±0.00인 것에 비해 분화용 배지를 처리하고 FG를 처리하지 않은 군의 흡광도는 0.14±0.00로 그 값이 350% 증가하여 분화용 배지에 의해 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화되었음을 확인 할 수 있었다. 이에 비해 FG를 처리한 결과 5 μM FG를 처리한 군에서의 흡광도가 0.08±0.02로 0 μM FG 군에 비해 57% 수준으로 흡광도가 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 이상의 결과로부터, FG는 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방구 형성을 억제하는 것으로 나타났다.

Fig. 4. . Effect of FG on lipid accumulation in 3T3-L1 cells. 3T3-L1 cells were treated with media for differentiation in the absence or presence of FG (0, 1, 2.5, 5 μM) for 12 days. On day 12, 3T3-L1 cells were stained with Oil red O solution and took a photograph (A). Then, (B) Lipid accumulation was assessed by extracting Oil red O from stained 3T3-L1 cells. The results are reported as the mean±SEM of three independent experiments (n=4). Statistical significance is based on the difference when compared with negative group (^**p<0.01; ^***p<0.001) or with 0 μM FG (^#p<0.05), respectively.

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지방생성(adipogenesis)은 다능성 간엽줄기세포(multipotent mesenchymal stem cell)가 성숙 지방세포로 분화하는 발달적 과정으로(14), PPARγ와 C/EBPα와 같은 전사인자의 복잡한 네트워크에 의해 엄격하게 조절된다(15-18). 특히, PPARγ은 지방세포 분화의 주요 조절자로서 FABP4, 지방산 합성효소, GLUT4와 같은 지방형성 유전자들뿐만 아니라 지방방울(lipid droplet) 관련 단백질을 암호화하는 유전자들을 활성화시키는 지방생성 인자이다(19-22). 또한, 마우스 embryonic fibroblast에서 C/EBPα를 제거하면 지방전구세포의 분화 능력이 감소하고, 지방분화에 있어 중요한 전사 인자인 PPARγ의 mRNA가 발현되지 못한다고 알려져 있다. 같은 세포에 PPARγ 유전자를 주입하면 지방구세포로 분화가 된다(23). 이처럼 C/EBPα는 우선적으로 PPARγ의 발현을 유도함으로써 지방생성에 있어서 중요한 역할을 한다.

따라서 FG가 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방 생성억제효과에 대한 분자적 메커니즘을 검토하기 위해서, 지방생성과 관련된 전사인자(PPARγ과 C/EBPα) 및 관련 단백질(FABP4)의 발현에 미치는 영향을 western blot 분석법을 통해 검토하였다. 그 결과 분화용 배지로 12일간 배양하였을 때 분화배지를 처리하지 않은 군에 비해 PPARγ의 발현이 현저히 증가하였다. 반면, FG 처리에 의해 PPARγ의 발현이 유의적으로 감소하였다(Fig. 5). 이와 더불어 PPARγ의 표적 유전자이자 지방 생성의 주요한 표지자 중 하나인 FABP4의 발현양도 3T3-L1 지방전구세포의 분화에 의해 현저히 증가하였으나, FG 처리에 의해 FABP4의 발현이 유의적으로 감소하였다(Fig. 6). 반면 C/EBPα는 분화용 배지로 12일간 배양하였을 때 분화 전에 비해 C/EBPα의 발현이 유의적으로 증가하였으나 FG 처리에 의해 C/EBPα의 발현에는 영향을 주지 않았다. Rosen의 보고에 따르면 PPARγ은 지방생성에 절대적으로 필요하지만 C/EBPα는 일차적으로 세포에서 PPARγ의 수준을 증가된 상태로 유지하도록 함으로써 지방 분화에 있어서 PPARγ에 비해 보조적인 역할을 한다고 보고하였다(14). 또한, C/EBPα는 분화된 지방세포에서 인슐린 민간성을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있어(14,24), FG가 지방세포가 인슐린 민감성을 획득하는 과정은 저해하지 않으면서 PPARγ에 따른 지방 축적을 억제하는 것으로 생각된다. 이상의 결과로부터, FG는 PPARγ 전사인자의 발현 및 관련 표적 유전자의 발현을 특이적으로 억제함으로써 지방분화를 억제하는 것으로 나타났다.

Fig. 5. . Effect of FG on expression of PPARγ, FABP4, and C/EBPα in 3T3-L1 cells. 3T3-L1 cells were treated with media for differentiation in the absence or presence of FG (0, 1, 2.5, 5 μM) for 12 days. In each whole cell lysate, 10 μg of proteins was resolved by 10% SDS-PAGE for FABP4, PPARγ, and C/EBPα determination. β-actin expression is shown as a loading control. The bands were quantified using image analysis software, and their relative intensities were expressed as target protein/β-actin. The results are reported as the mean±SEM of three independent experiments (n=3). Statistical significance is based on the difference when compared with negative group (^**p<0.01; ^***p<0.001) or with 0 μM FG (^#p<0.05; ^##p<0.01), respectively.

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