유색 소립콩 분말 두유의 젖산발효 중 이화학적 특성, 식물성 에스트로겐 및 항산화 활성 변화

본 연구에 사용된 유색 소립콩인 풍산나물콩(노란색, 10.25 g/100 ea), 녹채콩(녹색, 9.73 g/100 ea), 갈채콩(갈색, 9.14 g/100 ea) 및 다원콩(검정색, 11.26 g/100 ea)은 경상남도 밀양군 농촌진흥청 국립식량과학원 남부작물부에서 2013년에 재배 및 수확된 것을 공급받아 사용하였다(Fig. 1). 두유 발효를 위한 유산균은 최근 보고된 결과를 바탕으로 두유 발효 중 젖산 생성력과 우수한 β-glucosidase 활성에 의해 total phenolics와 비배당체 isoflavone 함량을 크게 증가시켜 유효성분 강화 발효두유 제조에 최적인 L. plantarum P1201 균주를 사용하였다(12,13). 미생물 배양 배지로는 Lactobacill MRS broth(MRS, Becton, Dicnson Co., Sparks Glencoe, MD, USA)를 사용하여 유산균 배양에 사용하였다. 12종류의 isoflavone 중 비배당체(daidzein, glycitein, 및 genistein)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 배당체 중 daidzin, genistin, glycitin은 Indofine(Hillsborough, NJ, USA)에서 구입하였으며 malonylglycosides 및 acetylglycosides 배당체 형태는 LC Laboratories(Woburn, MA, USA)에서 구입하였다. 한편 β-glucosidase 활성에 사용된 기질인 p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside(p-NPG)는 Sigma-Aldrich사에서 구입하여 본 연구에 사용하였다. Glacial acetic acid, Folin-Cialteu phenol reagent, 2,2-diphenyl-1-picrydrazyl(DPPH), 2,4,6-azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)와 ferric reducing antioxidant power(FRAP) 환원력 측정은 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ) 는 Sigma-Aldrich 제품을 구입하여사용하였다. Methanol, acetonitrile 및 water는 J.T.Baker사(Philipsbug, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였고 그 외 나머지 기타 시약은 필요에 따라 특급 혹은 1급을 구입하여 사용하였다.

Fig. 1. . Photograph and comparison of the seed weight of colored small soybean cultivars. A, Pungsannamul soybean; B, Nokche soybean; C, Galche soybean; D, Dawon soybean.

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유산균 종균배양은 MRS 액체배지에 접종하여 35℃에서 48시간 배양하여 사용하였다. 한편 유색 소립콩 분말은 콩 1,000 g에 물을 3배 가수한 후 25±3℃에서 6시간 불린 후 물기를 제거하고 100℃에서 1시간 증자하고 55±2℃에서 3일간 열풍건조한 후 100 mesh 정도로 분말화하여 준비하였다. 두유 제조는 250 mL 유리병에 유색 소립콩 분말 10 g과 발효 기질로서 설탕 5 g을 칭량한 후 물 100 mL를 첨가 및 혼합하여 121℃에서 15분 살균하여 제조하였다. 이 후 상온(15-25℃)으로 적당히 식힌 후 종균 배양액을 5.0%(v/v) 접종하고 35℃에서 60시간 정치 발효시켜 발효 두유를 최종적으로 제조하였으며 12시간 간격으로 시료를 채취하여 본 연구에 사용하였다(11).

pH는 pH meter(model 3510, Jenway, Essex, UK)를 사용하여 측정하였다. 총산은 중화적정법으로 시료 1 mL를 pH 8.3±0.1까지 중화시키는데 소비된 0.1 N NaOH의 양을 구하고 젖산으로 환산하였다. 생균수는 멸균생리식염수로 단계별 희석하여 MRS 평판배지에 도말한 후 30℃에서 48시간 배양 후 나타난 집락수를 계수하였다. 발효 중 β-glucosidase 활성 측정은 Hwang 등(12)의 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 우선 각각의 소립콩 발효 두유 5 mL에 5 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0) 50 mL를 첨가 및 혼합하고 4℃에서 30분간 4,000 rpm의 속도로 원심 분리한 후 상등액을 0.45 μm 필터로 여과하여 조효소를 제조하였다. 조효소 250 μL에 100 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0) 250 μL를 가한 후 37℃에서 15분간 예비 반응을 진행하였다. 여기에 인산나트륨 완충용액(pH 7.0) 함유 p-NPG(5 mM) 250 μL를 가하여 다시 37℃에서 30분 반응시킨 후 탄산나트륨 용액(200 mM) 250 μL를 가하여 효소반응을 종결시키고 분광광도계를 사용하여 405 nm에서 방출된 p-nitrophenol의 양을 측정하였다. 이때 β-glucosidase 활성의 효소단위인 1 unit은 상기 조건에서 1분당 p-NPG의 1 μM을 유리하는 효소 양으로 정의하였다.

발효 두유 추출물은 Hwang 등(11)의 방법에 준하여 제조하였다. 즉, 동결건조 분말 1 g에 10배의 50% 메탄올을 가하고 상온에서 12시간 추출하였다. 추출물은 원심분리기(MF-530, Hanil, Seoul, Korea)를 이용하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하고, 상등액을 취하여 0.45 μm membrane filter(Dismic-25CS, Toyoroshikaisha, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 후 추출물의 최종 농도를 100 mg/mL로 제조하여 total phenolics와 isoflavone 함량 및 항산화 활성 측정을 위한 시료로 사용하였다. 한편 추출물의 수율 계산은 추출전의 각각의 콩 분말의 중량과 동결건조 후 건조 중량에 대해 백분율(%)로 계산하였으며 아래의 식에 대입하였을 시 본 연구의 추출물 수율은 평균 70%로 나타났다.

$\mathrm{추}\mathrm{출}\mathrm{물}\mathrm{ }\mathrm{수}\mathrm{율}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{콩}\mathrm{ }\mathrm{분}\mathrm{말}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{증}\mathrm{량}\left(\mathrm{g}\right)}{\mathrm{동}\mathrm{결}\mathrm{건}\mathrm{조}\mathrm{ }\mathrm{후}\mathrm{ }\mathrm{건}\mathrm{조}\mathrm{ }\mathrm{증}\mathrm{량}\left(\mathrm{g}\right)}\times 100$

Total phenolics 함량은 Lee 등(13)의 방법과 동일하게 수행하였다. 발효 두유 추출물 0.5 mL를 시험관에 분주하고 25% Na₂CO₃용액 0.5 mL를 첨가하여 3 min 정치시켰다. 다시 2 N Folin-Ciocalteu phenol 시약 0.25 mL를 첨가하여 혼합한 다음 30℃에서 1시간 동안 정치시켜 발색시켰다. 발색된 청색을 분광광도계(Spectronic 2D, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 total phenolics 함량은 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 산출 하였다.

Isoflavone 함량 분석은 최근 보고된 Hwang 등(14)의 방법에 준하여 high performance liquid chromatography(HPLC, Agilent 1200 series, Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia)로 분석하였다. 분석 column은 Lichrophore 100 RP C₁₈ column(4.6×250 mm, 5 μm, Merck, Germany)을 사용하였고 이동상 용매는 0.2% glacial acetic acid in water(A line)와 0.2% acetonitrile in glacial acetic acid(B line)로 분석하였다. 이동상 조건은 A line 기준으로 0분-100%, 15분-90%, 25분-80%, 35분-75%, 45분-65% 및 50분-65%로 유지하였다. 시료는 20 μL를 주입하였으며, 이동상은 30℃에서 분당 1 mL의 유속을 유지하였으며 diode array detector(DAD)를 사용하여 UV 254 nm에서 검출하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 Joo 등(15)의 방법에 따라 수행하였다. DPPH 에탄올 용액 0.8 mL와 각 추출물 0.2 mL를 가하고 충분히 혼합한 후 암실에서 30분 방치 후 분광광도계를 사용하여 523 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 두유 추출물 대신 메탄올 0.2 mL를 취하여 실험하였으며 실험구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 백분율(%)로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거 활성 역시 Joo 등(15)의 방법에 준하여 측정하였다. 7 mM ABTS^⦁+ 5 mL과 2.45 mM K₂S₂O₈ 5 mL를 섞어 암실에서 12-16시간 방치 시킨 후 732 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 메탄올로 희석한 ABTS^⦁+ 용액을 사용하였다. 각각의 추출물 0.1 mL와 ABTS^⦁+ 용액 0.9 mL를 첨가하여 혼합한 후 정확히 3분 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 시료 추출물 대신 메탄올 0.1 mL를 취하여 실험하였으며, 실험구와 음성 대조구의 흡광도를 구하여 백분율(%)로 나타내었다.

FRAP 측정은 Hwang 등(11)의 방법을 참고하여 수행하였다. Acetate buffer(30 mM, pH 3.6), TPTZ 시약(10 mM in 40 mM HCl), 및 FeCl₃ 용액(20 mM in distilled water)을 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 측정 시약을 조제 하였다. 이 후 항온기(37℃)에서 15분간 예비반응 후 추출물 50 μL와 FRAP 시약 950 μL를 시험관에 분주하고 15분 반응시켜 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 추출물 대신 메탄올을 사용하였다.

실험 결과는 SPSS 12.0 package를 사용하여 분산 분석을 수행하였으며 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료의 분석 결과에 대한 유의성 검정은 분산 분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였다. 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.

유색 소립콩의 두유 발효 과정 중 pH, 총산, 생균수 및 _β-glucosidase 효소활성 변화는 Table 1과 같았다. 발효 전 평균 pH는 6.28 범위였으며 발효 과정 중 점차적으로 감소하여 3.96-4.12 범위를 나타냈으며, 발효 60시간째 평균 4.03으로 감소하였다. 총산은 pH 감소에 따라 비례적으로 증가하였으며, 최종 1.08%로 풍산나물콩 발효두유에서 가장 높은 수치를 나타내었고 생균수는 대부분 36-48시간까지 증가하다 60시간째 감소하였으나 콩 품종에 따른 큰 유의적 차이는 없었다. β-Glucosidase 활성 측정 결과 모든 유색 소립콩 두유는 발효 전 0.01-0.05 U/mL로 효소활성이 나타나지 않았다. 그러나 발효 12시간째부터는 효소활성을 조금씩 나타났으며 발효 과정 중 서서히 증가하는 경향을 나타내었다. 발효 60시간째에는 1.69 U/mL로 풍산나물콩 발효두유가 가장 높은 효소활성을 나타내었고 이를 이어녹채콩 발효두유가 1.60 U/mL의 효소활성을 나타내었고 갈채콩 발효두유(1.52 U/mL)와 다원콩 발효두유(1.48 U/mL) 순으로 β-glucosidase 활성을 나타내었다.

pH 감소는 젖산균이 생성한 젖산에 기인 한 결과로 젖산발효 중 pH 감소 및 총산의 증가 현상은 이미 일반적으로 많이 알려져 있다(16,17). 한편 발효 60시간째 생균수는 약간 감소하는 경향을 나타내었으며 이는 미생물 증식곡선 중 사멸기에 들어선 것으로 추측하였으며 미생물 종류에 따라 그 차이는 있으나 이 결과 역시 이미 보고된 연구와 유사하였다(18). 한편 β-glucosidase는 β-D-glucopyranoside 결합에 대해 특이성을 보이는 가수분해 효소로 최적 반응 pH 범위는 3-7로 알려져 있다. 특히 최근 Hwang 등(12)의 콩 품종별 발효두유 연구에서는 유산균의 β-glucosidase 활성에 대해 보고하였고 효소활성의 범위는 본 연구와도 유사하였다. 부가적으로 발효 과정 중 유산균이 생성하는 β-glucosidase는 최적의 효소반응 환경에서 phytochmical 계열의 항산화 성분을 증가시킨다는 연구 결과들이 보고되었다(19,20).

Total phenolics 함량은 발효 과정 중 서서히 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 2). Total phenolics 함량은 풍산나물콩 < 녹채콩 < 갈채콩 < 다원콩 순으로 가장 높았으며, 다원콩은 발효 전 2.92 mg/g에서 발효 60시간째 3.03 mg/g로 서서히 증가하였다. 갈채콩 역시 비교적 높은 함량을 나타내었고 발효 60시간째에는 2.99 mg/g으로 다원콩에는 약간 못 미치는 수준이었다. 한편 가장 낮은 함량을 나타낸 풍산나물콩은 발효 60시간째 다원콩과 비교하였을 시 약 1.7배의 함량 차이가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 검정콩에 함유된 anthocyanin 함량에 기인한 것으로 사료되었다.

Fig. 2. . Change of total phenolic contents during the lactic acid fermentation of soy powder milk with colored small soybean by the potential probiotic Lactobacillus plantarum P1201. Data represented mean±SD of three replicates. All values within a column with different superscript letters are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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활성산소종(reactive oxygen species)은 보통 인체의 호흡과정에서 몸 속으로 들어간 산소가 산화과정과 대사과정을 반복적으로 거쳐 생성되며 과잉 생성 시 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소로 정의된다. 한편 super oxide, hydrogen peroxide, hydroxyl과 같은 free radical은 노화의 주요 원인으로 이러한 문제를 예방하기 위해 과거부터 오늘날까지 항산화 효능이 우수한 polyphenol에 대한 연구가 활발히 이루어졌다(5,21,22). 특히 생리활성 물질 중 anthocyanin은 꽃이나 과실 등에 포함되어 있는 색소 배당체로서 검정콩에 상당량 함유되어 있다(23). 또한 주요 성분인 cyanidin-3-glucoside (C3G)및 delphinidin-3-glucoside(D3G)가 우수한 활성을 나타낸다고 Lee 등(21)과 Kim 등(24)이 보고하였다. Kong 등(25)도 anthocyanin 함량에 따라 생리활성이 우수하다 보고하였고 이와 유사한 연구 결과들이 보고되어 있다(24). 따라서 이러한 결과를 종합적으로 볼 때 본 연구 또한 검정콩 혹은 유색콩에 함유된 anthocyanin 혹은 pro-anthocyanin 화합물에 기인한 것으로 추측되며 유색콩 껍질의 anthocyanin 혹은 pro-anthocyanin 함량에 따라 항산화 활성 차이가 나타난 것으로 사료된다.

Isoflavone 함량 변화를 분석한 결과 Table 3과 Figs. 3-4에 나타낸바와 같았다. 일반적으로 콩의 isoflavone은 12가지 화합물로써 4개의 그룹으로 구분되며 본 연구에서는 총 9종류의 배당체(daidzin, glycitin, genistin, malonyl-daidzin, malonyl-glycitin, malonyl-genistin, acetyl-daidzin, acetyl-glycitin, 및 acetyl-genistin) 및 3종류의 비배당체(daidzein, glycitein, 및 genistein)가 검출되었다(Fig. 3A-H). 그러나 녹채콩에서는 peak 6번 acetyl-daidzin이 검출되지 않았고(Fig. 3C) 발효 60시간째에는 peak 11번인 acetyl-genistin이 검출되지 않았다(Fig. 3D). 또한 갈채콩 및 다원콩에서는 peak 11번 acetyl-genistin이 공통적으로 검출되지 않았다(Fig. 3E-H). 전체적인 HPLC 크로마토그램 변화는 발효가 진행됨에 따라 glycosides(peak 1-3) 형태가 줄어들고 비배당체 isoflavone(peak 9,12) 형태가 증가하였으며, acetyl-glycosides 및 malonyl-glycosides(peak 4-8,11) 형태는 발효가 진행되는 동안 큰 변화가 없는 것으로 나타났다(Fig. 3A-H). 비배당체 isoflavone(daidzein, glycitein, 및 genistein) 함량은 발효 60시간 후 풍산나물콩에서 151.04 μg/g이 검출되었고, 녹채콩-93.62 μg/g, 갈채콩-86.47 μg/g, 및 다원-97.67 μg/g이 검출되었다(Table 3). 한편 다원콩은 발효 전 glycosides 형태 비율이 80.36%였으나 발효 60시간째 66.06%로 감소하였고 이에 상응하여 5.61%의 비배당체 isoflavone 형태는 발효 60시간째 23.55%를 나타내었으며 풍산나물콩(25.54%)과는 유의적 차이는 없었다(Fig. 4A-D). 그 외 발효 60시간째 비배당체 isoflavone 비율로는 녹채콩-20.20%(Fig. 4B) 및 갈채콩 두유에서 20.35%(Fig. 4C)를 나타내었다.

Fig. 3. . HPLC chromatograms of isoflavones in SPM (0 h) and fermented SPM (60 h) extracts. A, isoflavones in SPM (0 h) extract of Pungsannamul; B, isoflavones in fermented SPM (60 h) extract of Pungsannamul; C, isoflavones in SPM (0 h) extract of Nokche; D, isoflavones in fermented SPM (60 h) extract of Nokche; E, isoflavones in SPM (0 h) extract of Galche; F, isoflavones in fermented SPM (60 h) extract of Galche, G, isoflavones in SPM (0 h) extract of Dawon; H, isoflavones in fermented SPM (60 h) extract of Dawon. 1, daidzin; 2, glycitin; 3, genistin; 4, malonyldaidzin; 5, malonyglycitin; 6, acetyldaidzin; 7, acetylglycitin; 8, malonylgenistin; 9, daidzein; 10, glycitein; 11, acetylgenistin; 12, genistein.

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Fig. 4. . Change of isoflavone rate during the lactic acid fermentation of soy powder milk with colored small soybean by the potential probiotic Lactobacillus plantarum P1201. A, Pungsannamul soybean; B, Nokchea soybean; C, Galchea soybean; D, Dawon soybean.

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두류 식품에서의 배당체 및 비배당체의 가장 큰 변화 요인은 발효미생물이 가지는 β-glucosidase 활성에 의한 것이라고 보고되어있다(26-28). 본 연구에서는 Marazza 등(19)과 Rodriguez-Roque 등(29)의 결과와 마찬가지로 발효가 진행됨에 따라 젖산균이 생성하는 젖산과 β-glucosidase 활성에 의해 당 결합이 끊어지면서 결과적으로는 9종류의 배당체 isoflavone 함량이 감소하는 반면, 비배당체 isoflavone 함량이 증가하는 것으로 최종 판단하였다.

소립콩 두유 발효 과정 중 라디칼 소거활성 및 환원력 변화는 Fig. 5와 같았다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 전체적으로 발효 과정에 따라 증가하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 풍산나물콩이 발효 60시간째 40.58%의 가장 낮은 활성을 나타내었고 다원콩은 95.25%로 가장 우수하였다(Fig. 5A). ABTS 역시 풍산나물콩이 발효 60시간째 51.44%, 다원콩 82.77%의 활성을 나타내어 DPPH 라디칼 소거활성과 완벽히 일치하는 경향을 나타내었다(Fig. 5B). 이러한 라디칼 소거활성 결과와 마찬가지로 FRAP 환원력 역시 발효 과정 중 점차 증가하였고, 발효 60시간째 다원콩은 1.79 환원력으로 가장 우수하였다(Fig. 5C). 한편 녹채콩 및 갈채콩은 라디칼 활성 및 환원력이 발효 중 증가는 하였으나 그 활성은 다소 낮은 결과를 나타내었다(Fig. 5A-C).

Fig. 5. . Change of DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging activities and FRAP assay (C) during the lactic acid fermentation of soy powder milk with colored small soybean by the potential probiotic Lactobacillus plantarum P1201. Data represented mean±SD of three replicates. All values within a column with different superscript letters are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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DPPH 측정은 α-diphenyl-β-picrylhydrazyl 라디칼의 소거능을 이용한 방법으로 현재까지도 가장 광범위하게 항산화 활성 측정에 사용되고 있다(30). ABTS 역시 DPPH와 같은 원리지만 수용성 및 지용성 물질 모두를 측정할 수 있는 특징이 있다(31). Kim 등(24)은 콩 원료에 따른 항산화 활성 차이는 anthocyanin과 같은 색소화합물 함량에 비례한다고 보고하였고, Tsangalis 등(26), Zhao 등(18,28), 및 Hou 등(17)도 두유의 젖산발효 중 비배당체 isoflavone 함량이 크게 증가한다고 보고하였다. 따라서 본 연구의 우수한 항산화 활성은 발효 중 생성 된 비배당체 isoflavone과 anthocyanin 함량 차이에 그 이유가 있을 것으로 판단되어 향후 anthocyanin에 대한 추가 분석이 필요할 것으로 사료된다. 이로써 L. plantarum P1201 유산균을 사용하여 제조한 유색 소립콩 발효두유는 적당한 산미를 형성함과 동시에 비교적 우수한 β-glucosidase 활성을 나타내며 특히 발효 과정 중 비배당체 isoflavone 및 항산화 활성이 증가하므로 여성 호르몬 대체재로써 충분한 효과를 가질 수 있을 것으로 사료된다.