시중 유통 중인 향신료가공품의 미생물학적 안전성 평가

본 실험에 사용된 재료는 시중 유통 중인 고춧가루 45건, 후춧가루 28건, 생강가루 29건, 마늘가루 17건, 총 119건의 향신료를 사용하였다. HACCP 인증 유무에 따라 향신료를 구분하면 HACCP 인증제품 37건, HACCP 미인증제품 82건이었으며, 원산지에 따라 구분하면 국내산이 54건, 수입산이 65건이었다.

시료 25 g을 정밀히 달아 멸균인산완충희석액 225 mL를 가하여 균질기(BagMixer^Ⓡ400, Interscience, St Nom, France)로 60초간 균질화하여 시험 원액으로 하였다. 시험 원액을 10단계 계단 희석하여 시험용액으로 하였다.

일반세균 및 대장균군 정량 실험은 식품공전(1)에 따라 실험하였다. Sanita-kun 건조필름(Chisso Corp., Tokyo, Japan)에 각각의 시험 용액 1 mL를 분주하고, 일반세균은 35℃ 배양기(Daewon, DS-110M, Bucheon, Korea)에서 48시간 배양하여 생성된 붉은색 집락을 계수해 측정하였으며, 대장균군은 35℃에서 24시간 배양하여 생성된 푸른색 집락을 계수하였다.

식중독세균은 시험원액 1 mL를 tryptic soy broth(TSB; Oxoid, London, England) 10 mL에 접종한 후 35℃, 24시간 배양하였다. 배양된 균액을 eppendorf tube에 1 mL 취한 후 원심분리기(Smart R17, Hanil scientific, Gimpo, Korea)를 이용하여 12,000 rpm, 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 멸균증류수 1 mL를 가하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이 과정을 3회 반복한 후 eppendorf tube에 멸균증류수 1 mL를 가하여 99℃ Heating block(HB-96D, set, Daihan scientific, Wonju, Korea)에서 10분간 가열하였다. 가열 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 polymerase chain reaction(PCR) 주형 DNA로 사용하였다. 식중독균은 Multiplex Pathogen Detection Kit(Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 확인하였다. PCR 조건은 95℃, 10 min→(95℃, 35 sec→60℃ , 30 sec→72℃ 30 sec) 35 cycle→72℃, 10 min으로 실험하였다. 식중독균의 특이유전자를 확인하기 위하여 2% 아가로즈 겔 상에 증폭시킨 PCR product 5 μL를 로딩 하여 110 V에서 50분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 UV trasilluminator(Biomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, E. coli O157, Yersinia enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus 등 7종의 식중독균 특이유전자 밴드를 확인하였다.

PCR을 이용한 식중독 세균 실험에서 B. cereus 밴드가 확인된 시료를 식품공전 B. cereus 정성시험에 따라 mannitol egg yolk polymyxin agar(MYP; Oxiod)배지를 이용하여 실험하였다. 시험 용액 200 μL를 MYP배지에 spreading한 후 30℃ 배양기에서 24시간 배양하여 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락을 확인하였다. MYP 배지에서 전형적인 집락이 확인된 균주를 tryptic soy agar(TSA; Oxoid)에 접종하여 35℃, 24시간 배양한 후 API 50 CHB 또는 Vitek BCL(bioMérieux, Inc., Marcy l’Etoile, France)을 이용하여 동정하였다.

독소 유전자는 식중독 세균 실험에서 사용한 DNA를 이용하였다. 각각의 독소유전자 primer(nheA, nheB, nheC, hblC, hblD, hblA, entFM) 8 μL, 추출 DNA 4 μL, 증류수 8 μL를 PCR primix(Bioneer, Daejeon, Korea) tube에 분주하였으며 각각 primer sequence는 Table 1에 나타내었다. PCR 반응은 95℃, 30 sec→(95℃, 30 sec→60℃, 1 min→72℃ 1 min) 35 cycle→72℃, 5 min으로 실험하였다. DNA를 증폭한 후 독소 유전자를 확인하기 위하여 2% 아가로즈 겔 상에 PCR product 5 μL 로딩 후 110 V에서 50분간 전기영동 하였다. 전기영동 결과 밴드 형성 여부를 확인하여 독소 유전자 유무를 판정하였다.

독소단백질 확인을 위해 시험원액 1 mL를 tryptic soy broth(TSB; Oxoid) 10 mL에 접종 한 후 35℃, 24시간 배양하였다. 배양액을 12,000 rpm, 10분간 원심분리한 후 상층액을 독소단백질 실험에 사용하였다. B. cereus가 생산하는 대표적인 독소단백질인 Hemolysin BL enterotoxin(HBL) 생산능은 B. cereus Enterotoxin-Reversed Passive Latex Agglutination kit(BCET-RPLA; Oxoid)를 사용하여 제조사가 제시하는 방법에 따라 실시하였다.

통계처리는 SPSS V17.0(SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 통계처리 프로그램을 이용하였다. 독립표본 t-test로 두 집단 간의 평균값을 비교하였으며 유의수준 p<0.05로 각각 향신료의 일반세균수와 대장균군수의 유의적 차이를 검증하였다.

본 실험에 사용된 향신료는 Table 2에 나타내었으며 HACCP 인증 여부와 원산지에 따라 분류하였다. 고춧가루는 45개 중 35개 제품이 HACCP 인증, 10개 제품이 HACCP 미인증 제품이었으며, 31개 제품은 국내산, 14개 제품은 중국 등 수입 제품이었다. 후춧가루는 28개 제품 중 2개 제품이 HACCP 인증, 26개 제품이 HACCP 미인증 제품이었으며, 28개 제품 모두가 인도네시아 등 수입 제품이었다. 생강가루는 29개 제품 모두 HACCP 미인증 제품이었으며 15개 제품은 국내산, 14개 제품은 수입 제품이었다. 마늘가루는 17개 제품 모두 HACCP 미인증 제품이었으며 7개 제품은 국내산, 10개 제품은 수입 제품이었다.

HACCP 인증 여부와 원산지에 따른 향신료의 일반세균 정량시험 결과는 Table 3에 나타내었다. HACCP 인증 여부에 따른 고춧가루 일반세균 오염도는 HACCP 인증 제품의 경우 6.5±0.6 log CFU/g, HACCP 미인증 제품의 경우 6.2±0.8 log CFU/g으로 유의적 차이가 나타나지 않았다. 후춧가루는 HACCP 인증 제품에서 평균 2.2±1.3 log CFU/g, HACCP 미인증 제품에서 평균 4.8±2.3 log CFU/g으로 HACCP 미인증 제품이 높은 오염도를 나타내었다. 생강가루, 마늘가루는 모두 HACCP 미인증 제품이었으며 각각 6.0±1.7 log CFU/g, 5.0±0.8 log CFU/g의 오염도를 나타내었다. 전체적인 향신료의 일반세균 오염도는 HACCP 인증 제품에서 평균 6.2±1.2 log CFU/g으로 나타났으며 HACCP 미인증 제품은 평균 5.4±1.8 log CFU/g으로 HACCP 인증 제품이 약간 높은 오염도를 나타내었으나 HACCP 인증 유무에 따른 일반세균수는 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

원산지에 따른 향신료의 일반세균 오염도는 국내산 고춧가루에서 평균 6.5±0.7 log CFU/g, 수입산 고춧가루에서 평균 6.2±0.5 log CFU/g으로 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 후춧가루는 모두 수입제품이었으며 평균 4.6±2.3 log CFU/g으로 나타났다. 생강가루는 국내산이 평균 6.5±1.9 log CFU/g, 수입산이 평균 5.4±1.4 log CFU/g으로 나타났으나 유의적 차이가 나타나지 않았다. 마늘가루는 국내산이 평균 5.2±0.8 log CFU/g, 수입산이 평균 4.8±0.9 log CFU/g으로 유의적 차이가 나타나지 않았다. 전체적인 향신료의 일반세균 오염도는 국내산 제품이 평균 6.3±1.2 log CFU/g으로 나타났으며 수입산은 평균 5.1±1.8 log CFU/g으로 나타나 국내산 제품이 수입산보다 높은 오염도를 나타내었다.

고춧가루의 일반세균 오염도는 HACCP 인증 여부, 원산지와 무관하게 모두 6.0 log CFU/g 이상으로 높은 수치를 나타내었으며 이러한 결과는 Jeong 등(17)의 적외선 살균 전 고춧가루 일반세균수 오염도가 6.1 log CFU/g였다는 보고와 유사하였고, Park 등(16)의 적외선 살균 전 고춧가루 일반세균수 오염도가 5.0 log CFU/g, Woo 등의 연구결과(19) 5.1 log CFU/g보다 다소 높게 나타났다. 이는 Solberg 등(20)이 제시한 조리되지 않은 식품의 미생물 판정 기준인 6.0 log CFU/g 이상으로 면역기능이 약한 사람에게 식중독을 일으킬 가능성이 있을 것으로 판단된다(21). HACCP 인증을 받은 고춧가루는 제조 공정 중 자외선을 이용하여 미생물을 살균하고 있으며 Park 등(16)의 연구결과 고춧가루의 자외선 살균 후 일반세균은 5.0 log CFU/g에서 3.9 log CFU/g까지 감소하였다고 보고하였다. 본 실험 결과 HACCP 인증 고춧가루의 일반세균수 오염도는 6.4±0.6 log CFU/g으로 나타나 자외선 살균공정 등 고춧가루 제조 HACCP 시스템에 대한 종합적인 점검과 보완이 필요한 것으로 판단된다. 본 실험에 사용된 후춧가루는 모두 수입산이었으며, 일반세균수 오염도는 Mok 등(22)의 연구결과인 3.0 log CFU/g 보다 높게 나타났다. HACCP 인증 유무에 따른 일반세균수 오염도는 HACCP 인증 제품이 HACCP 미인증 제품에 비하여 2.6 log CFU/g 낮아 후춧가루 제조 공정에 HACCP 시스템 도입 확대가 필요한 것으로 판단된다. 시중 유통 중인 생강가루와 마늘가루는 HACCP 인증 제품이 없었으며, 5.0 log CFU/g 이상으로 높은 일반세균수가 검출되어 적절한 위생관리 시스템의 도입이 필요한 것으로 판단된다.

HACCP 인증 여부와 원산지에 따른 향신료의 대장균군 정량시험 결과는 Table 4에 나타내었다. 고춧가루는 HACCP 인증 제품에서 대장균군이 37.1% 검출되었으며, HACCP 미인증 제품에서 30.0% 검출되어 HACCP 인증 제품에서 더 높은 대장균군 검출률이 나타났다. 후춧가루는 HACCP 인증 제품에서 대장균군이 검출되지 않았으며, HACCP 미인증 제품에서 검출률 38.5%로 나타났다. 생강가루와 마늘가루는 모두 HACCP 미인증 제품이었으며 생강가루의 검출률은 48.3%로 나타났으며, 마늘가루에서는 대장균군이 검출되지 않았다. 전체적인 향신료의 대장균군 오염도는 HACCP 인증 제품에서 검출률 35.1%, HACCP 미인증 제품에서 검출률 32.9%로 HACCP 인증 제품에서 약간 높은 검출률을 나타내었다.

원산지에 따른 대장균군 오염도는 국내산 고춧가루에서 검출률 45.2%, 수입산 고춧가루에서 검출률 14.3%로 국내산 제품에서 더 높은 검출률을 나타내었다. 후춧가루는 모두 수입제품이었으며 검출률 35.7%로 나타났다. 생강가루는 국내산이 검출률 60.0%, 수입산이 검출률 35.7%로 나타나 국내산 제품에서 더 높은 검출률이 나타났다. 전체적인 향신료의 대장균군 오염도는 국내산 제품에서 검출률 41.8%, 수입산 제품에서 검출률 25.4%로 국내산 제품에서 더 높은 대장균군 검출률을 나타내었다.

본 실험 결과 고춧가루 대장균군 오염도는 Woo 등(19)의 연구결과인 1.5 log CFU/g, Lee 등(23)의 연구결과인 3.4 log CFU/g, Kwon 등(24)의 연구결과인 4.3 log CFU/g보다 낮은 오염도를 나타내었으나, 대장균군 검출률이 35.6%로 위생상 문제점을 내포하고 있었다. 후춧가루와 생강가루는 대장균군 검출 보고가 매우 미약하여 본 실험 결과와 직접적으로 비교하지 못하였으나, 대장균군 검출률이 각각 35.7%, 48.3%로 나타나 위생상 문제점을 나타내었다. 마늘가루는 마늘의 alicin 성분이 대장균에 항균 작용을 가진다는 연구결과(25)로 보아 마늘의 항균 작용에 의하여 대장균군이 검출되지 않은 것으로 판단된다. 향신료의 전체적인 대장균군 오염도는 HACCP 인증여부, 원산지와 관계없이 높게 나타나 적절한 위생관리 시스템의 도입과 함께 생산단계부터 농산물의 대장균군 오염을 관리할 수 있는 농산물우수관리 제도(good agricultural practice; GAP) 도입이 필요할 것으로 판단된다.

향신료의 식중독세균 실험결과는 Table 5에 나타내었으며 119건의 향신료 중 17건(13.9%)에서 B. cereus가 검출되었으며 L. monocytogenes, E. coli O157, Y. enterocolitica, V. parahaemolyticus, Staph. aureus, Salmonella spp. 등의 식중독 세균은 검출되지 않았다. 고춧가루 22.2%에서 B. cereus가 검출되었으며 HACCP 인증 제품에서 20%, HACCP 미인증 제품에서 30% 검출되어 HACCP 미인증 제품의 B. cereus 오염도가 높은 것으로 확인되었다. 고춧가루 중 B. cereus 오염도를 원산지별로 구분해보면 국내산이 21.9%, 수입산이 23.9% 검출되어 원산지별 차이는 나타나지 않았다. 후춧가루의 경우 13.3%에서 B. cereus가 검출되었으며 모두 HACCP 미인증 제품에서 검출되었고 수입산 이었다. 생강가루의 경우 10.0%에서 B. cereus가 검출되었으며 모두 HACCP 미인증 제품이며, 원산지로 구분하면 국내산 12.5%, 수입산 7.1%로 국내산 제품의 B. cereus 오염도가 더 높게 나타났다.

B. cereus는 자연에 널리 분포하는 포자 형성 식중독세균으로 가열처리하여도 제거되지 않아 고춧가루, 후춧가루, 생강가루에서 검출된 것으로 판단된다. 자외선과 적외선을 이용하여 살균을 진행하는 HACCP 인증 고춧가루 제품에서도 B. cereus가 검출되었는데 이는 고춧가루의 자외선 및 적외선 살균이 충분히 이루어지지 않았거나 오염된 B. cereus가 포자를 형성하여 사멸되지 않은 것으로 판단된다. 따라서 고춧가루 HACCP 살균 공정의 보완이 필요할 것으로 판단된다. 후춧가루, 생강가루는 모두 HACCP 미인증 제품으로 B. cereus를 제어할 수 있는 적절한 위생 관리 시스템의 도입과 함께 생산단계 B. cereus 오염을 관리할 수 있는 GAP 제도 도입이 필요할 것으로 판단된다.

분리 동정된 B. cereus 식중독균의 독소 유전자 특성과 독소 생산능 실험 결과는 Table 6에 나타내었다. B. cereus 17건 모두에서 nheB, nheC, entFM 독소 유전자가 검출되었으며, 16개(94.1%) 균주에서 nheA 독소 유전자가 검출되었다. hblC, hblD, hblA는 각각 10개(58.8%) 균주에서 독소유전자가 검출되었으며, HBL 독소단백질은 9개 균주(52.9%)에서 검출되었다. 검출된 B. cereus의 독소유전자를 종합해 보면 17균주 모두 한 가지 이상의 독소유전자를 가지고 있으며, 9개 균주(52.9%)에서 HBL 독소단백질이 확인되어 향신료에 오염된 B. cereus에 의한 식중독 발생 가능성이 상존하는 것으로 판단된다.

B. cereus는 구토형과 설사형의 식중독을 일으키는데, 그 중 설사형 식중독은 잠복기가 8-16시간이며 B. cereus에 오염된 식품을 섭취한 후 생성된 enterotoxin에 의해 발병 한다(26). 본 실험에서 분리된 B. cereus 독소 유전자는 설사형 식중독을 일으키는 nheABC, hblCDA로 국내에서 분리된 B. cereus의 주요 독소 유전자와 일치하였다(27). HBL enterotoxin은 B. cereus의 대표적인 설사 독소로 hblC, hblD, hblA 독소 유전자로부터 생산되는 것으로 보고되고 있으며(28), 본 실험 결과 HBL enterotoxin을 생산하는 균주는 모두 hblC, hblD, hblA 독소 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었다. B. cereus의 설사형 식중독은 소스, 푸딩 등 단백질 식품에서 빈번하게 발생하며, 충분한 가열이 이루어지지 않은 식품을 상온에 보관할 경우 빠르게 증식하여 식중독을 일으킬 가능성이 있다(29). 향신료 가공품은 조리 시 풍미 증진을 위하여 소량 사용되나 B. cereus에 오염 된 향신료를 사용한 식품이 상온에 장시간 방치될 경우 B. cereus가 증식하여 식중독이 발생할 가능성이 상존하는 것으로 판단되었다.

이러한 결과를 종합하여 볼 때 시중 유통되고 있는 향신료 제품의 경우 HACCP 인증 여부와 관계없이 대장균군 및 B. cereus 오염도를 나타내어 향신료 재배에 GAP 제도를 도입하여 대장균군 등 미생물 오염 원인을 관리하고 기존 HACCP 시스템의 미생물 살균공정을 개선하여야 할 것으로 판단되었다.