생균제제 효모 Kazachstania exigua CCSY27 및 쌀누룩을 이용하여 제조한 쌀-밀 막걸리의 품질 특성

본 연구에서 막걸리 제조에 사용한 멥쌀은 한국 경상남도 함양군 소재 함양농협미곡처리장에서 구입하였고, 밀은 진주시 소재 반성면에서 재배된 금강 품종의 우리밀을 사용하였으며, 대조구로 사용한 시판 누룩은 진주시 중앙시장에서 통상적으로 판매되고 있는 산성 누룩, 송학 누룩, 진주 누룩을 구입하여 사용하였다.

쌀누룩 제조에 사용한 Rhizopus oryzae 곰팡이 균주는 이전 연구결과에서 분리된 것을 사용하였다(Cho 등, 2012). 선발된 효모는 우선 chloramphenicol(1.5 mg/mL)이 함유된 potato dextrose agar(PDA, Difico, Becton, Dicnso, Co., Sparks) 배지에 도말하여 37°C에서 3일간 배양 후 16,500 rpm의 속도로 3분간 원심분리하여 배양액은 거른 뒤 균체만을 회수하였으며, 이 과정을 3회 반복하여 균체를 수집하였다. 확보된 균체는 DNAzol kit(iNtRON Biotechnology, Suwon, Korea)를 사용하여 일련의 과정을 통해 genomic DNA를 분리하였다. 분리된 genomic DNA를 주형으로 하여 26S rDNA PCR(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 증폭을 수행하였다. PCR 증폭은 1분간 변성(94°C), 30초간 풀림(52°C) 및 신장(72°C) 과정을 30회 반복 수행하였다. 한편, 26S rDNA 단편 증폭을 위한 primer는 Joo 등(2011) 연구방법에서 사용한 균주를 사용하였다. PCR 증폭 후에는 증폭된 26S rDNA 산물은 agarose(1%)에 전기영동하고 단편(0.6 kb)을 회수하여 pGEM-T Easy 벡터를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝 후, Escherichia coli DH5α에 형질전환 후 형질전환체를 PDA 배지에 무작위로 순수분리하였다. 순수분리한 형질전환체를 항생제(ampicillin) 함유 Luria Bertani 배지(LB, Difico, Co., Detroit, MI, USA)에 접종하여 16시간(37°C) 배양 후 균체를 수집하고 plasmid 정제 kit(Intron, Suwon, Korea)에 수록된 절차대로 plasmid를 분리 및 정제하였다. 26S rDNA 염기서열 분석은 BLAST Search Service와 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 기존에 알려진 다른 균주들과 비교분석하여 최종적으로 동정하였다.

생균제제 효모를 확보하기 위해 균주 분리는 우선 전통주(탁주)와 식초, 식물효소발효액으로부터 최초 200여 종 이상의 전형적인 효모 형태의 콜로니를 분리하여 PDA 배지에 배양 및 확보하였다. 이후 백미와 도정밀에서 알코올 발효능과 발효특성(맛, 향 등)이 우수한 효모 균주를 잠정적으로 22종을 선정하였다.

내산성 검증은 분리된 효모들을 potato dextrose broth (PDB, Difico, Becton, Dicnso, Co., Sparks)(30°C) 배지에서 2일간 배양시키고, 3 M HCl을 첨가하여 pH 3.0으로 조정된 새로운 PDB 배지에 10⁶ CFU/mL의 농도로 새로이 접종하였다. 접종된 효모들을 37°C에서 3, 6시간 배양 후 PDA 배지에 도말하여 생균수를 측정하였으며 생존율은 초기 세포 농도와 PDA 배지상에 형성된 효모의 colony 비율을 비교하여 %로 계산하였다(Kang과 Lee, 2012).

펩신 저항성은 PDB 배지에 펩신(1%)을 첨가하여 pH를 3.0으로 조절하여 인공위액산 환경을 제조하였으며, 측정방법은 내산성과 동일한 방법으로 실시하였다(Kang과 Lee, 2012).

담즙산 내성은 Ha 등(2004)의 방법을 조금 변경하여 측정하였다. Mann Rogosa Sharp(MRS, Becton, Dicnso, Co., Sparks) 배지에서 2일간 배양한 균체(30°C, 10⁶ CFU/mL)를 다른 농도(1.0–4.0% w/v)의 담즙산 함유 MRSA 배지상에 spoting 하였다. 그 후 37°C에서 2일간 배양하였으며, 담즙산의 최소저해농도는 spot을 육안검사로 판정하고 spot에서 균 생장을 전적으로 저해시키는 최소농도로 결정하였다.

막걸리 담금 전, 누룩 제조를 위해 우선 R. oryzae CCS01 곰팡이 포자를 PDA 배지에 이식 및 성장시킨 뒤 곰팡이 배양 plate를 멸균증류수(100 mL)에 현탁시키고 살균된 탈지면에 여과하여 포자(6.0 log spores/mL)를 수집하고, 누룩 제조를 위한 종균으로 사용하였다. 한편, 누룩 제조는 멥쌀 6 kg을 깨끗한 물로 충분히 세척 후 상온(25°C)에서 하루가량 침지시킨 후 1시간 정도 물기를 제거하였다. 물기가 제거된 멥쌀에 미리 준비한 R. oryzae CCS01 현탁액(100 mL)과 멸균증류수(200 mL)를 차례로 가한 후 반죽하였으며 누룩틀에 반죽을 채우고 다져 누룩을 성형하였다. 이후에는 각 성형된 누룩을 네모난 쟁반에 담고 한지로 덮은 후 균사 성장을 위해 20°C에서 5일간 발효를 시켰다. 발효가 끝난 누룩은 자연건조 후 분쇄하여 분말 형태로 제조하였으며, 이 누룩은 냉장(4°C) 보관하면서 필요에 따라 꺼내어 본 실험에 사용하였다.

한국 고유 품종의 밀은 1 kg을 칭량하여 세척 후 충분한 물을 가수한 뒤 상온(15–25°C)에서 4시간 침지 후 물기를 제거하고 100°C에서 1시간 증자처리를 실시하였다.

막걸리 제조는 R. oryzae CCS01 곰팡이 균주로 제조한 쌀 누룩과 시판 누룩(산성, 송학, 진주) 400 g과 용수를 각각 600 mL를 발효조에 첨가하여 25°C에서 하룻동안 발효시켜 밑술(1단 담금)을 제조하였다. 밑술 제조 후 미리 제조해 두었던 우리밀(증자) 400 g을 추가로 투입시키고, 생균제제 효모 배양액 50 mL(5%)를 접종하여 25°C에서 7일간 발효시켜 2단 담금을 실시하였다. 7일간 발효된 각각의 막걸리는 4겹의 여과천으로 여과한 것을 본 실험에 사용하였다.

pH는 각각의 막걸리 50 mL를 비이커에 옮겨 담고 pH meter(MP 200, JenWay, London, UK)를 사용하여 측정하였다. 산도는 pH 측정 후 0.1 N-NaOH 용액으로 중화적정 하여 pH 8.4±0.1까지 중화하는데 소비된 mL수를 구하고 acetic acid 양으로 환산하였다.

가용성 고형물 함량은 각각의 막걸리들을 16,500 rpm의 속도로 3분간 원심분리기(MF-530, Hannil, Seoul, Korea)로 상등액을 분리하고, 따로 취한 뒤 굴절당도계(Sccharometer, W.S.R.O-90, Atago Co., Tokyo, Japan)로 당도를 측정하였다.

알코올 함량은 삼각플라스크에 각각의 막걸리(10 mL)와 물 90 mL를 첨가하고 소포제 일정량(0.3 mL)을 떨어뜨린 후 증류과정을 거쳐 20 mL의 순수 알코올을 회수하였다. 이후 20 mL의 알코올에 동량의 증류수를 가한 후 주정계(MT-830, Atago Co., Tokyo, Japan)로 측정하여 %로 나타내었다.

갈변도는 막걸리 상등액을 일정량 취하여 분광광도계(Spectonic 2D, Thermo, Electron Co., Marietta, OH, USA)를 사용하여 420 nm에서 측정하였으며 각 실험은 3회 반복수행하여 평균값으로 나타내었다.

유산균수는 여과한 각각의 막걸리를 멸균생리식염수로 단계별 희석법을 통해 bromocresol purple(BCP) 0.02% 함유 MRS 평판배지에 도말하고, 37°C에서 2일간 배양 후 황색 colony를 계수하였으며 효모는 chloramphenicol(1.5 mg/mL) 함유 PDA 배지에 도말하여 흰색의 탁한 전형적인 효모 colony를 계수하였으며, 각 실험은 3회 반복 수행 후 colony forming unit(log CFU/mL)으로 표시하였다.

각 실험 결과는 SPSS 12.0 package(IBM)를 사용하여 분산분석을 수행하였으며 평균±표준편차로 나타내었다.

본 연구에서 잠정적으로 선발된 효모 균주들의 산, 펩신, 담즙산에 대한 저항성 측정결과, 내산성의 경우 산(pH 3.0) 조건에서 3시간 이후 50% 이상의 생존율을 보인 것은 CCSY13번 균주를 제외하고는 모두 식초에서 분리된 균주(CCSY01, CCSY02, CCSY16, CCSY18 및 CCSY27)였고, 이들 중 CCSY16번 균주를 제외하고 모두 pH 3.0 조건에서 배양 3시간 이후 60% 이상의 생존율을 보였다(data not shown). 펩신 저항성 측정 결과로는 22종류의 효모 균주들 중 CCSY01, CCSY02, CCSY13, CCSY18번 균주가 3시간후에도 50% 이상의 생존율을 보였으며 특히 CCSY27번 균주는 60.8%로 가장 우수한 생존율을 나타내었다(data not shown). 담즙산 내성에서는 CCSY02 균주의 경우 담즙산(1–4%) 환경에서 생육속도가 가장 저조하였고, 이외 나머지 분리균주들은 생육속도가 활발한 것으로 조사되었다(data not shown).

한편, 이 외에도 당과 알코올 내성 측정결과 대부분의 효모 균주들은 우수하였고 특히 CCSY27번 균주가 각종 내성과 알코올 생성력 및 발효특성이 가장 우수하여 막걸리 제조를 위한 최적 균주로 선정하고 분자유전학적 동정을 실시하였다. 생균제제 효모 CCSY27번 균주의 26S rDNA 염기서열을 NCBI data-base와 비교분석한 결과는 Fig. 1,2와 같았다. 그 결과, 기존에 알려진 Kazachstania exigua CBS379 균주와 99%의 상동성을 나타내어 최종적으로 본 연구에서 분리한 효모를 Kazachstania exigua CCSY27로 명명하였다.

Fig. 1. 26S rDNA sequencing listing of CCSY27 strain.

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Fig. 2. Phylogenetic relationships of the strain CCSY27 and other closely related Kazachstania and Saccharomyces species based on 26S rDNA gene sequences. Numbers above each node are confidence levels (%) generated from 1,000 bootstrap trees. The scale bar is in fixed nucleotide substitutions per sequence position. Only values of 60% or above are shown.

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생균제제 K. exigua CCSY27 효모를 이용하여 제조한 쌀-밀 막걸리와 시중에 판매 중인 산성, 송학, 진주 누룩으로 제조한 쌀-밀 막걸리 및 R. oryzae 곰팡이를 이용하여 제조한 쌀-밀 막걸리의 발효 과정 중 pH 변화를 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 시판 누룩(산성, 송학, 진주)은 발효초기 pH가 4.45(산성), 4.67(송학), 4.93(진주)에서 발효가 진행됨에 따라 조금씩 감소하여 발효 7일차에는 3.73(산성), 3.78(송학) 및 3.74(진주) 수준이었고, R. oryzae 이용 쌀누룩은 발효초기 4.14에서 발효 7일차에 4.05로 약간 감소하였다. 한편, 산도는 발효초기 진주누룩이 0.44 mL로 가장 낮았으며, 산성누룩이 0.86 mL로 가장 높았으나 발효 1일째 모든 누룩에서 산도가 급격히 증가하였고, 이후에는 서서히 증가하는 추세를 나타내었다. 쌀누룩의 경우 발효초기 0.68 mL에서 발효 7일차에는 1.12 mL로 증가하였으나 시판누룩은 쌀누룩보다 약 0.5–2.0배 정도 많은 양의 산이 생성되었다(Fig. 4). 막걸리의 품질은 알코올과 여러 영양성분에 의해서도 결정되지만 pH 역시 발효진행 상황과 알코올 생성 정도를 대략 짐작할 수 있는 중요한 인자 중 하나이다(Kim과 Yi, 2010). Seo 등(2012)의 R. oryzae CCS01 곰팡이로 제조한 쌀-밀 막걸리 연구에서는 발효초기 pH는 급격히 감소하였으나 발효가 진행될수록 점차적으로 증가하였고, 이는 본 연구에서의 pH 변화와도 유사한 패턴을 보였다. Choi 등(2011)의 보고 역시 시판누룩으로 석탄주를 제조하고 발효하였을 시 발효 초기 pH는 급격히 감소한 반면, 발효 중기부터 완만히 증가한다고 하여 이 또한 본 연구 결과와도 일치하였다. 일반적으로 pH가 감소하면 이에 비례적으로 총산은 증가하며 pH가 증가하게 되면 총산 역시 비례적으로 감소해야 하나, 본 연구뿐만 아니라 여러 막걸리 관련 연구에서는 총산이 증가하는 것으로 보고되었다. 이와 관련해서 여러 연구에서는 보통 발효 중기부터 발효산물인 아미노산과 펩타이드 완충작용에 의해 pH와 총산 모두 증가하는 것이라 보고되었다(Kim 등, 2011b; Seo 등, 2012).

Fig. 3. Comparisons of pH value of the commercial ‘Nuruk’ and wheat-rice ‘Makgeolli’ by K. exigua CCSY27.

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Fig. 4. Comparisons of acidity value of the commercial ‘Nuruk’ and wheat-rice ‘Makgeolli’ by K. exigua CCSY27. Sanseong, songhak, and jinju: commercial ‘Nuruk’. Rice: Using Rhizopus oryzae CCS01.

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K. exigua CCSY27 효모를 이용하여 제조한 쌀-밀 막걸리와 시판누룩으로 제조한 쌀-밀 막걸리의 가용성 고형물 함량을 측정한 결과는 Fig. 5에 나타낸 바와 같다. °Brix는 발효초기 2.6 °Brix(쌀누룩), 2.4 °Brix(송학), 3.2 °Brix(산성) 및 2.6 °Brix(진주)에서 발효 2일째 급격히 증가하여 7.2 °Brix(쌀누룩 및 송학), 7.4 °Brix(진주)와 8.0 °Brix(산성) 수준이었고, 이후 발효가 진행됨에 따라 서서히 증가하여 발효 7일차에는 8.8 °Brix(송학), 8.6 °Brix(진주), 및 9.2 °Brix(쌀누룩 및 산성) 수준을 나타내었다(Fig. 4). 한편, 알코올 함량은 발효 1일차에 6%(산성), 4%(송학 및 진주)를 나타내었고 쌀누룩의 경우 7%로 알코올 함량이 가장 높았다(Fig. 6). 이후 발효 기간이 경과함에 따라 알코올은 꾸준히 증가하는 경향을 나타내었고 발효 7일차에 각각 9%(산성), 8.8%(송학), 8.6%(진주), 쌀누룩은 13.6%로 알코올 함량이 가장 많이 생성되었다. 막걸리 발효 중 갈변도 변화는 발효가 진행됨에 따라 서서히 증가하였고 발효 7일차에 각각 1.008(산성), 0.623(송학), 0.877(진주), 0.428(쌀누룩)의 흡광도 수치를 나타내었으며 시판누룩으로 제조한 막걸리는 쌀누룩으로 제조한 막걸리보다 약 0.5–2.0배 정도 갈변도가 높은 것으로 나타났다(Fig. 7). 부가적으로, 유산균과 효모의 생균수는 발효초기 104(효모)–105(유산균) 수준이었고, 발효 7일차에는 유산균과 효모 모두 107의 세포수를 나타내었으며 시판누룩에서는 특유의 누룩치가 잔존하여 관능적으로 음용하기에는 조금 부담스러운 것으로 조사되었다(data not shown).

Fig. 5. Comparisons of soluble solid content of the commercial ‘Nuruk’ and wheat-rice ‘Makgeolli’ by K. exigua CCSY27. Sanseong, songhak, and jinju: commercial ‘Nnuruk’. Rice: Using Rhizopus oryzae CCS01.

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Fig. 6. Comparisons of alcohol content of the commercial ‘Nuruk’ and wheat-rice ‘Makgeolli’ by K. exigua CCSY27. Sanseong, songhak, and jinju: commercial ‘Nnuruk’. Rice: Using Rhizopus oryzae CCS01.

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Fig. 7. Comparisons of browning value of the commercial ‘Nuruk’ and wheat-rice ‘Makgeolli’ by K. exigua CCSY27. Sanseong, songhak, and jinju: commercial ‘Nnuruk’. Rice: Using Rhizopus oryzae CCS01.

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당의 존재는 발효 과정 중에 효모의 알코올 생성기작에 직접적으로 관여하며 특히, 가용성 고형물 증가 현상은 누룩 발효 과정 중 곰팡이 유래 전분 분해효소에 의해 α-amylase와 glucoamylase 활성 증가와 직접적인 요인이 있는 것으로 보고되었다(Park 등, 2013). Seo 등(2012)의 연구 역시 막걸리 발효 중 당도는 꾸준히 증가하였고 Kim 등(2012)의 설기떡과 마늘을 첨가한 막걸리 발효 연구 결과 역시 발효 진행에 따라 순차적으로 증가한다고 보고하였고 이는 본 연구 결과와도 일치하였다. 한편, 알코올은 주류의 보존성에도 영향을 미치지만, 향미에 영향을 주는 중요한 성분으로 술덧의 알코올 함량은 높아야 한다고 보고되었으며(Seo 등, 2012), α-amylase 효소활성도에 따라 알코올 생성량이 결정된다(Seo 등, 2012). 특히 Seo 등(2012)의 쌀-밀 막걸리 연구에서는 실제로 각 누룩들의 α-amylase 활성을 측정한 결과, 시판누룩(산성, 송학, 진주)보다는 쌀누룩에서 α-amylase 활성이 가장 높았고 이에 따라 알코올 함량 역시 가장 높았으며, 이 결과는 본 연구에서도 마찬가지로 쌀누룩의 알코올 함량이 7%로 가장 높았으며 α-amylase 활성도와 알코올 생성력은 비례하는 것으로 나타났다.

이로써 한국 고유의 품종인 우리밀(금강)과 한국의 전통 누룩에서 분리한 R. oryzae CCS01 균주와 생균제제능이 우수한 K. exigua CCSY27 효모 균주 사용 막걸리 연구는 수입 품목에 의존하지 않고 한국 고유의 미생물과 누룩을 이용한 점에 대해 학술적인 의미가 우수할 것으로 사료된다. 특히, 우리술의 새로운 전성기가 도래하고 있는 현 시점에서 본 연구 결과는 앞으로 다양한 형태의 막걸리 제조에 관한 기초자료로써 활용 가능할 것으로 판단된다.