개박하 추출물의 피부장벽 기능에 대한 효과

개박하(Nepeta cataria)는 2019년 5월 경기도 화성시 소재 농원에서 재배한 것을 직거래를 통하여 구입하였으며, 추출방법은 시료 30–40 g에 에탄올 200 mL를 첨가하고, 용매추출장치(ASE300 Accelerated Solvent Extractor, Dionex Corporation, Sunnyvale, USA)를 이용하여 50°C, 1,500 psi에서 20분 동안 추출하였다. 이후 건조기(Modul spin 40, Biotron Corporation, North Ryde, Australia)에서 40°C에서 24시간 동안 건조하고 실험에 사용하였다(Ahn 등, 2015).

세포독성 시험은 Kim(2018)의 연구에서 명기된 방법에 의해 수행하였다. 즉, 세포내의 미토콘드리아 수소제거효소에 의해 수용테트라졸륨염(water soluble tetrazolium salts)(WST-1)에서 불용성의 포마진(formazan)결정으로 변환되는 원리를 이용하였다. 포마진은 다이메틸설폭사이드(dimethly sulfoxide)에 녹아서 보라색 빛을 띄는데 분광광도계(spectrophotometer)로 540 nm 파장에서 OD값을 재어서 정량하였다. 미국 세포주은행(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받은 멜라노마 세포(murine melanoma B16F10)를 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Waltham, MA, USA)이 포함된 dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM)에서 배양하고, 24–well plate에 2×10⁴ cells/well 의 농도로 세포를 접종한 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 이후 배양세포에 추출물을 농도별로 처리하고 72시간 배양하였다(Ranke 등, 2004).

DPPH 라디칼(radical) 소거능 실험은 Kim(2018)의 연구에서 명기된 방법에 의해 수행하였다. 즉, 0.2 mM의 DPPH용액 0.8 mL에 식물추출물 시료 0.2 mL를 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 메탄올을 첨가하였고, positive control로 아스코빅산(ascorbic acid)를 사용하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID50)을 계산하여 DPPH 소거 활성 정도를 표현하였다. Free radical scavenging 활성은 [1−(시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)]×100의 계산식에 의해 활성(%)을 구하였다.

PPAR-α transcription 활성측정은 transactivation assay 방법으로 측정하였다(Kim 등, 2014). 한국세포주은행에서 구입한 CV-1 세포를 DMEM에서 배양하고 24 well plate에 4×10⁴ cells/well 의 농도로 배양한 후 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 universal promoter 뒤에 PPAR(유전자를 지닌 것과 리간드 결합형의 PPAR)이 결합하여 활성화되는 PPRE(PPARs Response Element)를 프로모터로 가지는 PPAR-α Expression vector(Qiagen, Hilden, Germany)를 구입하여 과발현시킨 것과, 리포터 역할을 하는 firefly luciferase 유전자 플라스미드와 참조로 사용될 유니버셜 프로모터에 Renilla luciferase 유전자가 결합된 플라스미드(SABiosciences, Hilden, Germany)를 구입하여 lipofectamine(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 transient transfection 시키고 시험 물질을 처리하고 추가 24시간 배양 후 1xPLB(Passive Lysis Buffer)로 세포를 분쇄한 후 DualLuciferase Reporter Assay System kit(Promega, Mannheim, Germany)를 사용하여 Luminometer로 luciferase 활성을 측정하였다.

피부보호막 형성의 필수요소인 filaggrin 형성촉진을 확인하고자 피부세포 배양 Human keratinocyte cell line인 HaCaT 세포주를 사용하여 mRNA 발현을 Kim의 연구에서 명기된 방법(Kim 등, 2014)에 의해 수행하였다. 전체 RNA를 UltraspectTM-II RNA system(Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX, USA)을 사용하여 준비하고, single-stranded cDNA를 avian myeloblastosis virus(AMV) reverse transcriptase를 사용하여 합성하였다. 반응액은 20 μL로 준비하였으며, 1 μg total RNA, 1’ reverse transcription buffer(10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 mM deoxynucleoside triphosphates(dNTPs), 0.5 U RNase inhibitor, 0.5 μg oligo(dT), 그리고 15 U AMV reverse transcriptase 포함하며, 42°C에서 15분간 배양하고, 99°C에서 5분간, 이후 0–5°C에서 5분간 배양하였다. Transcript levels은 iQ5 qRT-PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 분석하였다.

개박하 추출물에 의한 단백질 발현분석은 Kim 등(2014)의 연구에서 명기된 방법에 의해 수행하였다. 1차 항체(mouse anti-involucrin: 1 : 500, Santa Cruz Biotechnology, Carlsbad, CA, USA; mouse anti-ß-actin: 1 : 1,000, SigmaAldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 2차 항체(rabbit anti-mouse IgG-HRP: 1 : 5,000, Santa Cruz Biotechnology, Carlsbad, CA, USA)를 반응시켰다. 단백질밴드는 광 이미지 시스템(Chemi-Doc image system)(BIO-RAD, Hercules, CA, USA)기기를 사용하여 정량하였다.

모든 실험은 독립적으로 3회 반복 시행하고, 실험결과는 평균±표준평균오차로 표기하였으며, 통계처리는 GraphPad Prism 5 program(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 이용하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 일원배치 분산분석(one-way analysis of varience)을 한 후, 각 시료간의 통계적 유의성은 Bonferroni’s multiple comparison test를 이용하여 수행하였다.

멜라노마 세포에 개박하 추출물(N. cataria extract, NCE) 10 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL의 농도에서 각각 0%, 0.89%, 8.80%, 18.20%, 35.50% 독성이 나타났다(Fig. 1). 따라서 이후의 실험은 독성이 거의 없는 100 μg/mL 이하의 농도에서 진행하였으며, 함암효과로서 연구된 개박하 추출물의 논문에서도 독성이 없는 안전한 물질로 보고되었다(Fan 등, 2017).

Fig. 1. Cell cytotoxicity of Nepeta cataria extract (NCE) on murine melanoma B16F10 cell. NCE-untreated group was used as a negative control. Values are presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant, *p<0.05 compared to the control group, ^§p<0.05 compared to the NCE 10 μg/mL group.

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개박하 추출물 시료와 대조구 시료를 각각 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 제조하여 DPPH 소거활성을 측정한 결과(Fig. 2), NCE 각각에 대한 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL의 추출물 농도에서 90.20%, 92.70%, 93.70%를 보였으며, 대조구와 거의 차이가 없는(92.80%, 93.60%, 94.50%) 라디칼 소거활성을 나타냈다. 또한, 피부장벽 보호효과로서 보고된 루꼴라(Kim 등, 2014) 추출물의 50% 라디칼 소거활성 농도가 420 μg/mL를 보이는 것과 비교할 때, 산화방지 소재로서 더 우수한 개박하 추출물의 가능성을 확인할 수 있다.

Fig. 2. Anti-oxidant effects of Nepeta cataria extract (NCE). Ascorbic acid was used as a positive control. Values are presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant.

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개박하 추출물에 대한 세포독성이 없는 농도에서 PPAR-α transcription 활성을 측정하였다(Fig. 3). PPAR-α 작용제(agonist)로서 표준물질로 알려져 있는 WY14643(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 대조물질로 사용하였으며(Kim 등, 2014), NCE 추출물 시료의 농도가 증가할수록 PPAR-α 리간드 결합활성이 증가되는 경향을 보였으며 대조군 대비(3.5)하여 100 μg/mL의 NCE 농도에서 유사한 활성(3.7)을 확인하였다. 다른 천연소재 중 우수한 피부장벽 보호효과로서 보고된 루꼴라(Kim 등, 2014) 추출물의 경우와 비슷한 활성(3.6)을 보이는 것을 고려하면 본 연구의 개박하 추출물의 경우 우수한 표피의 분화와 표피 지질의 합성을 촉진함으로써 에너지 항상성을 조절하는 PPAR-α 작용제(agonist)로서 가능성을 확인할 수 있다.

Fig. 3. Transactivation of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-responsive element (PPRE) by different concentrations of Nepeta cataria extract (NCE). WY14643 and no treatment were used as a positive control and as a negative control respectively. Values are presented as means±standard error of the mean (SEM). *p<0.05 compared to the untreated group.

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Filaggrin은 정상피부의 가장 바깥층에 다량 존재하며, 피부보호막 형성의 필수요소로 피부의 수분을 유지하고 외부 이물질의 침투를 막아준다. 부족 시, 피부보호막이 깨지면서 이물질이 침투하고, 수분의 증발/손실이 발생하며, 상태가 악화되면 염증이 발생한다(Del Rosso 와 Kircik, 2013). 개박하 추출물에 의한 fliaggrin 발현에 미치는 영향을 시험하기 위하여 세포독성이 없는 농도에서 quantitative RTPCR을 측정하였다(Fig. 4). 양성대조군을 대비하여(0.62배) 100 μg/mL의 NCE 농도에서 높은 발현을 확인하였다(1.3배). 그러나, 양성대조군(WY14643)과 10 μg/mL, 50 μg/mL의 NCE 농도에서는 무처리 대조군에 비해 낮은 발현을 보였으며, 보다 정확한 발현 메카니즘을 확인해 볼 필요가 있다(Kim 등, 2014).

Fig. 4. Effect of Nepeta cataria extract (NCE) on expression of filaggrin.. WY14643 and no treatment were used as a positive control and as a negative control respectively. Values are presented as means±standard error of the mean (SEM). *p<0.05 compared to the untreated group

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피부장벽 보호 지표물질로서 cornified envelope(CE)에 관련된 단백질인 involucrin(Jensen 등, 2004) 발현에 대한 개박하 추출물의 영향을 측정하였다(Fig. 5). 무처리 대조군 및 양성대조군인 1.2 mM CaCl₂와 함께 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL의 NCE 농도에서 각각 198%, 221%, 261%로 농도가 증가함에 따라 involucrin 발현이 증가되었으며, 1.2 mM CaCl2 280%에 비해서는 다소 낮았다. 특히 100 μg/mL 농도에서는 양성대조군(280%)과 거의 비슷한 involucrin 발현증가(261%)를 보였다.

Fig. 5. Effect of Nepeta cataria extract (NCE) on expression of involucrin. Each signal was quantified by scanning densitometry. 1.2 mM CaCl2 and no treatment were used as a positive control and as a negative control respectively. Values were nomalized to β-actin before calculating changes and presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant, **p<0.01 compared to the control group.

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