녹차추출액과 유자액 혼합비율별 콤부차의 품질 특성

녹차 추출액 제조용 녹차 잎은 두손애 약초(Yeongcheon, Korea)에서 판매되고 있는 2020년에 수확하여 건조시킨 녹차 잎을 구입하여 실온에 보관하면서 사용하였고, 유자청은 전라남도 고흥에 위치한 두원농협(Goheung, Korea)에서 생산한 두힐고흥유자차(67 °Brix, 2020년산) 제품을 제공받아 4°C에서 냉장 보관하면서 시료로 사용하였다. 콤부차 발효에 사용된 스타터는 이엠생명과학연구원(Nonsan, Korea)에서 제조한 e콤부차 종균을 구입하여 사용하였다. 미생물의 구성은 Lactobacillus plantarum EMK01, Lactobacillus sakei EMK02, Lactobacillus patacasei EMK03, Lactobacillus casei EMK04, Lactobacillus brevis EMK05, Leuconostoc mesenteroides EMK06, Bacillus subtilis EMK07, Saccharomyces cerevisiae EMK08의 8종으로 구성되었다.

녹차추출액 제조는 녹차 잎 20 g에 온수 2 L를 가하여 12시간 추출하였다. 이후 추출된 녹차추출액에 설탕 10%를 첨가하였고, 유자액은 유자청(67 °Brix)에 정제수를 첨가하여 10 °Brix로 조정하고 여과를 통해 고형물을 제거하여 시료로 준비하였다. 제조된 녹차추출액과 10 °Brix로 조정한 유자액을 녹차추출액 100%, 녹차추출액 70%:유자액 30%, 녹차추출액 50%:유자액 50%, 녹차추출액 30%:유자액 70%의 혼합 비율에 맞게 각각 500 mL로 혼합하고, 콤부차 종균(e콤부차종균, Nonsan, Korea)을 1 g씩 넣은 뒤 30°C 배양기에서 20일간 발효시켰다. 제조 방법에 대한 공정도는 Fig. 1과 같다.

Fig. 1. Manufacturing method of kombucha.

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pH는 시료 15 mL를 취하여 pH meter(ATI ORION 940, Boston, MA, USA)를 사용하여 측정하였고, 적정 산도는 시료를 1 mL를 취한 후 1% phenolphthalein 지시약을 첨가하고, 0.1 N NaOH 용액으로 적정한 후 0.0064를 곱하여 citric acid로 환산하였다. 당도측정은 굴절당도계로 측정하여 °Brix로 나타내었다.

환원당 함량 변화는 발효 기간별 콤부차 시료 10 mL를 Somogyi 변법(Hatakana와 Kobara, 1980)에 의해 정량하여 glucose 함량으로 표시하였다. 알코올 함량 측정은 시료 100 mL를 취한 다음 증류수 약 30 mL를 넣어 혼합하고, 70 mL를 증류한 다음 증류수 30 mL를 혼합하여 100 mL로 정용하고, 15°C로 보정한 뒤 주정계를 사용하여 값을 읽고, Gay- Lussak의 주정환산표(NTS Liquors Licence Aid Center, 2010)를 이용하여 알코올 함량을 나타내었다.

유산균과 효모 농도 측정은 발효가 완료된 콤부차를 식품공전에 의한 방법(MFDS, Korean Food Code, 2021)으로 측정하였다. 유산균 농도는 MRS Broth(Difco lab., MI, USA), 효모 농도는 YM Broth(Difco lab., MI, USA)를 사용하였으며, 각 배양시간은 유산균은 37°C에서 24시간, 효모는 28°C에서 48시간 배양하고, 이를 3회 반복 계수하여 평균값을 구해 log CFU(colony forming units)/mL로 표시하였다.

총폴리페놀 함량은 Folin-Denis(Cha 등, 1999)법에 따라 측정하였다. 시료는 증류수를 사용하여 500배 희석한 시료 2 mL에 5% NaCO₃ 5 mL를 혼합한 뒤 3분 방치 후 Folin-Denis regent 2 mL를 혼합하고 30분 방치한 다음 분광광도계(HP 8453, Hewlett Packard, CA, USA)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 tannic acid (Sigma- Aldrich Co. St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 총플라보노이드 함량은 Davis법(Park 등, 2019)에 따라 측정하였다. 콤부차의 500배 희석한 시료 0.5 mL에 에탄올 1.5 mL, 10% 질산알루미늄 0.1 mL, 1 M 초산칼륨용액 0.1 mL, 물 2.8 mL를 혼합한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준물질로는 quercetin(Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.

관능평가는 순천대학교 식품공학과 대학원생 및 학부생 10명을 대상으로 실시하였으며, 종이컵에 미리 음료를 담은 뒤, 1-4번으로 표기하여 진행하였고, 하나의 음료를 평가한 후 물로 입을 헹구고 다음 음료를 평가하도록 하였다. 평가는 향, 색깔, 신맛, 단맛, 전체적기호도에 대해 7점 척도법으로 진행되었으며, 채점기준은 대단히 좋다: 7점, 아주 좋음: 6점, 보통 좋음: 5점, 약간 좋음: 4점, 좋지도 싫지도 않음: 3점, 약간 싫음: 2점, 아주 싫음: 1점으로 하였다. 관능평가는 순천대학교 생명윤리심의위원회 심의를 통해 승인(1040173- 202104-HR-005-02)을 받은 후 시행되었다.

통계처리는 실험결과를 3회 이상 반복 실시하여 SPSS 통계분석 프로그램(26, IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하였고, mean±SD를 구하였으며, Duncan’s multiple range test에 의해 평균치 간의 유의성을 검정하였다.

녹차추출액과 유자액 혼합비율별 콤부차의 pH, 적정 산도 및 당도 변화를 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 발효 전 시료구별 pH는 녹차추출액과 유자액의 혼합 비율에 따라 차이가 있었다. 녹차 100% 시료구가 가장 높은 값을 나타냈고, 유자를 첨가한 시료구는 유자의 첨가량이 증가할수록 낮은 값을 보였다. 유자는 citric acid와 malic acid, oxalic acid 등 다양한 유기산들이 함유되어 있고, 유기산의 총량 또한 다른 원료들에 비해 높다고 보고되었다(Kim 등, 2002). 따라서 유자에 포함된 유기산의 영향으로 유자 혼합 비율이 높아질수록 농도 의존적으로 pH가 낮게 나타난 결과로 판단된다. 발효기간에 따른 pH 변화는 녹차 100% 첨가 시료구가 발효 전 5.60에서 발효 5일째에 3.94로 급격히 감소하였고, 5일째부터는 일정하게 유지되었으며, 그 외 시료구는 발효 중 감소폭이 크지 않았다. 발효 종료 시점인 20일째는 발효 전 차이와 비슷하게 유자액의 혼합 비율이 높을수록 낮게 나타났다. 발효 전 적정산도는 pH 측정 결과와 반대로 유자액의 혼합 비율이 높을수록 적정산도가 높았다. 녹차 100% 첨가 시료구가 가장 낮은 값을 보였고, 유자 혼합 비율이 높아질수록 농도 의존적으로 높게 나타났다. 발효기간에 따른 음료의 적정 산도 변화는 상승하는 경향을 보여 발효대사가 정상적으로 진행되고 있음을 확인하였다. 발효 종료 시점인 20일째의 적정산도는 녹차추출액 100% 첨가 콤부차가 0.13%로 가장 낮았고, 녹차추출액 30:유자액 70 혼합비율에 콤부차가 0.23%로 가장 높은 값을 보였다. 본 연구에서는 발효 전 당도를 10.0 °Brix로 조정하여 발효를 진행하였다. 따라서 발효 전 당도는 모두 10.0 °Brix로 확인되었고, 발효가 진행되면서 모든 시료구의 당도는 감소하였으며, 발효 종료 시점인 발효 20일째에 시료구별 당도는 차이가 있었다. 시료구 중 녹차추출액 70:유자액 30 혼합비율로 발효한 시료구가 3.0 °Brix로 가장 낮은 당도를 보였고, 녹차추출액 30: 유자액 70 혼합비율의 시료구는 6.4 °Brix로 가장 높은 당도를 보였다. 이는 녹차추출액 제조시 설탕을 첨가하였고, 유자청을 희석해 제조한 유자액도 설탕이 포함되어 있어 제조된 콤부차의 주요 당류는 설탕이지만, 기존 녹차와 유자 원료에 포함되어 있는 당류의 조성이 다르기 때문에 그 차이가 발효 대사에 영향을 미쳤다고 판단된다.

Fig. 2. Changes in pH (A), titratable acidity (B) and °Brix (C) of kombucha made with a mixture of green tea extract and yuzu juice. A, the kombucha made with green tea extract 100%; B, the kombucha made with a mixture of 70% green tea extract and 30% yuzu juice; C, the kombucha made with a mixture of 50% green tea extract and 50% yuzu juice; D, the kombucha made with a mixture of 30% green tea extract and 70% yuzu juice. All values are mean±SD (n=3).

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콤부차의 환원당과 알코올 함량 변화를 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 환원당 함량은 발효 5일째까지 대부분의 시료구가 증가하다가 이후에 감소하는 경향을 보였다. 이러한 환원당 함량 변화 패턴은 전형적인 발효 대사에서 일어나는 과정으로 정상적인 발효가 진행되었고, 환원당을 기질로 종균 증식이 일어나면서 다양한 대사산물을 만들어 냈다고 판단할 수 있다(Gil 등, 2016). 발효 20일째 시료구별 환원당 함량의 차이는 녹차추출액 100% 비율로 발효한 시료구가 4.04%로 가장 높았고, 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율로 발효한 시료구가 1.68%로 가장 낮은 함량을 보였다.

Fig. 3. Changes in reducing sugar content (A) and alcohol content (B) of kombucha made with a mixture of green tea extract and yuzu juice. A, the kombucha made with green tea extract 100%; B, the kombucha made with a mixture of 70% green tea extract and 30% yuzu juice; C, the kombucha made with a mixture of 50% green tea extract and 50% yuzu juice; D, the kombucha made with a mixture of 30% green tea extract and 70% yuzu juice. All values are mean±SD (n=3).

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알코올 함량은 제조직후부터 10일째까지 변화가 없었고, 10일 이후부터 증가하는 경향을 보였다. 발효 20일째 알코올 함량은 녹차추출액 30:유자액 70의 혼합비율로 발효한 시료구가 2.4%로 가장 높았고, 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율로 발효한 시료구가 1.5%로 다음 순이었다. 콤부차는 다양한 세균과 효모 발효를 통해 제조되는 음료로서 효모는 알코올을 생성하는 미생물이 포함되어 있다(Kim 등, 2020). 본 연구에서 사용된 종균 조성에서도 S. cerevisiae EMK08 효모가 포함되어 알코올이 생성되었다고 판단된다. Shin(2021)의 녹차, 홍차와 백차를 이용한 콤부차의 발효 산물과 기능적 특성 비교 보고에서 발효 15일째 콤부차의 알코올 함량이 1.3-2.0%로 나타났다고 보고해 녹차추출액 30:유자액 70의 혼합비율로 발효한 시료구(2.4%)를 제외한 시료구는 유사한 결과를 보였다. 녹차추출액 30:유자액 70의 혼합비율로 발효한 시료구(2.4%)는 일반 음료 제품으로 출시하기 위해 차후 알코올 함량을 낮추는 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.

녹차추출액과 유자액의 혼합비율별 콤부차의 유산균 농도와 효모 농도를 측정한 결과는 Table 1과 같다. 유산균 농도와 효모 농도는 5.13-5.48 log CFU/mL와 4.60-5.45 log CFU/mL 수준으로 정상적인 유산균 발효와 효모 발효가 진행되었다. 시료구별 유산균 농도는 녹차추출액 30:유자액 70 혼합비율로 발효시킨 시료구가 다른 시료구에 비해 높은 균수를 보였으나, 전체 시료구의 유의적 차이가 없었고, 효모 농도 또한 녹차추출액 70:유자액 30 혼합비율로 발효시킨 시료구가 5.45 log CFU/mL로 가장 높았지만 시료구별 유의적 차이가 없었다. 유산균과 효모는 환원당을 주요 기질로 발효대사가 이루어져 젖산과 알코올을 생성한다. 본 연구에서의 환원당 함량 측정 결과와 관련해서 보면 발효 20일째의 유산균 농도와 효모 농도가 녹차추출액 70:유자액 30 혼합비율로 발효시킨 시료구가 가장 높은 균수를 보여 환원당 함량이 가장 낮게 나타난 결과로 판단된다. 유산균은 소비하는 당에 대하여 약 50% 이상의 유산을 대사 생산물로 생성하는 세균이며, 효능으로는 정장 작용, 면역증강 작용, 간경화 개선, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하기능, 피부미용 효과와 영양학적 가치를 증진시킨다고 보고되어 있다(Baek, 1993). 효모 또한 인체 건강에 유익한 작용을 하는 프로바이오틱스 기능이 있다고 보고되어 있다(Yoon과 Shin, 2017). 따라서 본 연구에서 제조된 콤부차의 경우, 유산균 농도와 효모 농도가 높은 수준으로 음료로서의 상품성이 있을 것으로 판단된다.

제조된 콤부차의 총폴리페놀과 총플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 폴리페놀 화합물은 대표적으로 항산화 효과와 다양한 기능성을 갖는 화합물로 알려져 있다(Park, 2005). 일반적으로 녹차와 유자의 기능성은 폴리페놀과 플라보노이드 성분이 대표성을 갖는다. 본 연구에서의 녹차추출액과 유자액의 혼합비율에 따른 콤부차의 총폴리페놀 함량을 측정한 결과, 17.55-40.79 mg TAE/mL의 함량을 보여 높은 폴리페놀 함량을 갖는 음료임을 확인하였다. 시료구별 총폴리페놀 함량은 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율로 제조한 콤부차가 40.79 mg TAE/mL로 가장 높았고, 녹차추출액 100%, 녹차추출액 50:유자액 50 혼합비율 및 녹차추출액 30:유자액 70 혼합비율로 제조한 콤부차는 17.55-22.45 mg TAE/mL의 함량이었다. Jeong 등(2009)은 시판 녹차 열수추출물의 총페놀성 화합물 함량을 분석한 결과, 72.03- 85.62 mg/g이었다고 보고하였고, Lee 등(2017)은 유자의 재배방법에 따른 부위별 총폴리페놀 함량을 측정한 결과, 과피의 총폴리페놀 함량이 0.68-0.85 mg/g이었다고 보고하여 녹차 첨가량이 많은 시료구가 총폴리페놀 함량이 높을 것으로 판단되었으나, 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율로 제조한 콤부차가 함량이 가장 높게 나타났다. 이는 앞의 결과에서 유산균 농도와 효모 농도가 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율 콤부차가 가장 높은 결과와 관계가 있는 것으로 판단된다. 미생물은 다양한 가수분해효소를 분비하며, 폴리페놀 화합물에서 가수분해효소는 phenolic glycosides를 가수분해시키고 aglycone을 생성시켜 phenolic 화합물을 증가시키는 역할을 한다(Jo 등, 2017). 따라서 균수가 높으면 분비되는 가수분해 효소량도 많을 수 있기 때문에 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율에 콤부차가 폴리페놀 함량이 높게 나타난 것으로 판단된다. 플라보노이드 화합물은 폴리페놀계열에 포함되는 화합물로서, 이 화합물 또한 다양한 기능성을 나타내는 화합물로 알려져 있다(Park 등, 2019). 시료구별 총플라보노이드 함량은 앞서 총 폴리페놀 함량 측정 결과와 동일하게 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율로 제조한 콤부차가 37.15 mg QE/mL로 가장 높은 함량을 보였고, 녹차추출액 100%, 녹차추출액 50:유자액 50 혼합비율 및 녹차추출액 30:유자액 70의 혼합 비율로 제조한 콤부차는 12.76-20.59 mg QE/mL의 함량을 보였다.

Fig. 4. Total polyphenol content (A) and total flavonoid content (B) of kombucha made with a mixture of green tea extract and yuzu juice. A, the kombucha made with green tea extract 100%; B, the kombucha made with a mixture of 70% green tea extract and 30% yuzu juice; C, the kombucha made with a mixture of 50% green tea extract and 50% yuzu juice; D, the kombucha made with a mixture of 30% green tea extract and 70% yuzu juice. All values are mean±SD (n=3). Means followed by the different lowercase letters in bar are significantly different(p<0.05, a>b>c>d).

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녹차추출액과 유자액 혼합비율에 따른 콤부차의 기호도를 7점 척도법으로 관능평가한 결과는 Table 2와 같다. 측정 결과, 향, 색, 신맛, 단맛 및 전체적인 기호도의 모든 항목에서 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율로 제조한 콤부차가 5.10, 5.00, 3.80, 4.30 및 4.30으로 가장 높은 기호도를 보였다. 녹차추출액 50:유자액 50의 혼합비율로 제조한 콤부차의 경우, 모든 평가 항목에서 3.60, 3.70, 2.90, 3.10 및 3.20으로 가장 낮은 기호도를 보였고, 녹차 100% 비율로 제조한 콤부차와 녹차추출액 30:유자액 70의 혼합비율로 제조한 콤부차의 경우 비슷한 기호도를 나타냈다. 기존 콤부차 제조 방법인 녹차만을 이용해 제조한 콤부차의 기호도와 비교했을 때 녹차추출액 70:유자액 30의 혼합비율로 제조한 콤부차의 기호도가 더 높게 나타나, 유자액을 첨가함으로써 콤부차의 품질 개선에 효과가 있다는 것을 확인하였다.