양파와 흑양파를 이용하여 제조한 식초의 품질 특성 및 항산화 활성

본 연구에 사용된 양파는 시중에서 구입하여 사용하였다. 식초 제조 시에 사용한 효모와 초산균 보존용 배지는 YPDA(0.5% yeast extract, 0.5% peptone, 2% dextrose, 1.5% agar) 배지를 사용하였으며, 배지 조성에 필요한 구성요소는 Difco사 제품(Becton Dickinson and Company, Detroit, MI, USA)을 사용하였다. 1,1’-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 Alfa Aesar(London, UK) 사에서 구입하였으며, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS⁺)는 Roche(Mannheim, Germany) 사에서 구입하여 실험에 사용하였다.

효모와 초산균 종균배양에 사용한 맥아 추출액 배지는 정수 1 L에 엿기름가루 200 g을 가하고 60°C에서 2시간 당화 후 여과하여 여액을 1 L로 조정한 후 121°C에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 효모 종균배양에 제조한 맥아 추출액 배지 100 mL가 들어 있는 250 mL Erlenmyer flask에 YPDA 배지에서 계대배양한 Saccharomyces cerevisiae (KCCM 11215) 균주를 1 백금이 접종하고 2일간 진탕 배양(150 rpm)하여 알코올 발효를 위한 종균으로 사용하였다. 초산균 종초 배양을 위해 1%(v/v) 에탄올을 보충한 엿기름 배지 100 mL가 들어 있는 50 mL Erlenmyer flask에 YPDA 배지에서 계대배양한 Acetobacter pasterianus A8(Shin, 2013) 균주를 1 백금이 접종하고 2일간 30°C에서 진탕 배양하여 초산 발효를 위한 종초로 사용하였다.

양파를 세척하여 물기를 제거한 다음 8등분 하여 65°C의 건조기에서 5일간 건조했으며, 흑양파는 65°C의 건조기에서 2주간 열처리한 후 동일한 조건에서 1주일간 추가적으로 건조했다. 건조된 양파와 흑양파 300 g을 믹서기로 마쇄한 다음 용수에 2.5배로 희석하였고, 천으로 걸러진 혼합액은 5 L 광구병에 담아 80°C에서 15분간 살균 처리하였다. 살균 처리 후 상온으로 냉각한 양파와 흑양파 혼합액에 효모 주모를 2.5% 접종하여 30°C에서 10일간 알코올 발효를 실시하였다. 그 후 알코올 농도를 6%로 조정하고 3일간 진탕 배양한 초산균 종초를 5% 접종하여 30°C에서 24일간 정치 발효시켰으며, 이를 이화학적 분석 및 항산화 활성 평가에 사용하였다.

시료는 원심분리기(Hanil Science Industrial Co., Kimpo, Korea)에서 3,000 rpm으로 15분간 원심분리한 뒤 상등액을 취하여 pH meter(Jenway, UK)를 사용하여 pH를 측정하였다. 총산도는 원심 분리한 시료 1 mL를 pH 8.2±0.1까지 중화시키는 데 소요된 0.1 N NaOH의 소비 mL 수를 구하고 아래 식에서와 같이 환산하였다.

유리당과 유기산은 HPLC(Agilent 1200 series, Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia) 기기를 이용하여 분석하였다. 유리당을 분석하기 위해 시료 5 g에 물 25 mL를 가하여 녹인 후 acetonitrile로 50 mL까지 채웠다. 이 용액을 Sep-pak NH2 column(Waters Co., Milford, MA, USA)과 0.45 μm membrane filter(Dismic-25CS, Toyoroshikaisha, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 액을 시험 용액으로 사용하였다. 당 분석 column(Polyamine II, 4.6×150 mm, 5 μm, YMC Co., Kyoto, Japan)에 시험용액 20 μL를 주입하고 35°C에서 이동상 용매[acetonitrile:water = 70:30(v/v)]를 1 mL/min 속도로 이동시키면서 refractive index(RI, Agilent 1200 series) 검출기 상에서 당을 검출하였다.

유기산 분석을 위해 시료를 원심분리기에서 3,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상등액을 0.2 μm membrane filter(Dismic-25CS, Toyoroshikaisha, Ltd.)로 여과하여 유기산 분석을 위한 시료를 준비하였다. 전 처리한 시료 20 μL을 TSK gel ODS-100V column(4.6×250 mm, 5 μm, Tosoh Corp., Tokyo, Japan)이 장착된 HPLC 시스템에 주입하고 30°C에서 이동상 용매(0.1% 16 phosphoric acid)를 1 mL/min 속도로 이동시키면서 UV 검출기를 이용하여 210 nm에서 유기산을 검출하였다. 유기산은 같은 조건으로 분석한 표준 유기산의 검량선과 비교하여 정량하였다.

각 시료 100 μL와 10% Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 200 μL를 혼합한 뒤 700 mM Na₂CO₃ 700 μL를 섞은 뒤 30분간 실온에 방치하였다. 반응이 끝난 후 650 nm에서 흡광도를 측정하였고, gallic acid를 이용한 검량선과 비교하여 mg gallic acid equivalents(GAE)/g으로 총 페놀 함량을 나타내었다(Gutfinger, 1981).

각 시료 150 μL와 5% NaNO₂ 75 μL를 섞은 후 6분간 실온에서 방치하였으며, 10% AlCl₃ 150 μL를 첨가하여 다시 5분간 방치하였다. 그 후 1N NaOH 750 μL를 혼합하여 15분간 반응시킨 다음 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총플라보노이드 함량은 quercetin을 이용한 검량선과 비교하여 mg quercetin equivalents(QE)/g으로 나타내었다(Moreno 등, 2000).

각 농도별로 ethanol에 녹인 시료와 60 μM DPPH 용액을 각각 100 μL씩 동량으로 혼합하여 실온에서 반응시켰다. 30분간 반응시킨 반응액을 540 nm에서 GloMax microplate reader(Madison, Wisconsin, WI, USA) 기기를 이용하여 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거능을 산출하였다(Hatano 등, 1989).

각 농도별로 증류수에 녹인 시료와 2.6 mM ABTS⁺ 시약을 동량으로 혼합하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 그 뒤, 반응액을 600 nm에서 GloMax microplate reader 기기를 이용하여 흡광도를 측정하여 시료의 ABTS⁺ 라디칼 소거능을 산출하였다(Re 등, 1999).

본 실험에서 측정한 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었으며, 통계 프로그램인 Statistical Package for the Social Sciences(version 25, IBM Corp., NY, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 구한 뒤, Duncan’s multiple range test를 사용하여 유의수준 0.05에서 유의성을 검증하여 결과를 분석하였다.

가공식품 제조 과정에서 비효소적 갈변 반응은 당과 아미노산을 amino-carbonyl 반응으로 식품의 색깔과 품질을 향상시키기 위해 많이 이용되고 있으며, Maillard reaction에 의해 생성된 갈색화 물질은 항산화 효능이 있는 것으로 보고되어 최근 갈변 물질에 대한 생리활성 연구가 활발하게 진행되고 있다(Lee 등, 2005; Lee 등, 2010). 갈변반응을 이용한 가공식품 중 대표적인 흑마늘의 경우, 생마늘을 일정한 온도와 습도 하에서 숙성 및 발효시킴으로써 마늘이 가지고 있는 특유의 자극적인 향과 매운맛이 감소되고, 단맛이 증가되었으며, 숙성과정에서 S-allyl-cystein(SAC)과 같은 유효성분이 증가되어 생마늘보다 항산화, 항염증, 항암, 콜레스테롤 저하 및 면역 개선 등의 효능이 나타난 것으로 보고되었다(Chung 등, 2011; Kang와 Shin, 2012; Shin 등 2008; Tak 등, 2014). 이전 연구에 의하면, 양파를 숙성 및 발효시킨 흑양파는 3,4-dihydroxybenzoic acid, quercetin 등의 생리활성 물질을 함유하고 있으며, 특히 일반 양파에 비해 in vitro에서 DPPH 및 ABTS⁺ radical 소거능이 증가하여 항산화 활성이 향상되는 것으로 보고되었다(Yang과 Park, 2011b; Yang 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 양파를 숙성 및 발효시켜 흑양파식초를 제조하고, 흑양파식초의 이화학적 품질 특성 및 항산화 활성을 양파식초와 비교하여 알아보고자 하였다.

양파식초 및 흑양파식초 제조 과정에서 0-8일간 알코올 발효 과정 중 알코올 함량 변화와 당도 변화를 Fig. 1에 나타내었다. 알코올 발효 과정 중 알코올 함량 변화를 측정한 결과(Fig. 1(A)), 양파식초는 0%에서 발효 1일째 5%, 8일에 9.6%의 알코올 함량을 나타낸 반면 흑양파식초는 0%에서 발효 1일째 1%, 8일에 7%의 알코올 함량을 나타내었다. 따라서 발효식초의 알코올 함량은 흑양파식초에 비해 양파식초가 더 높은 수치를 나타냄을 알 수 있었다. 알코올 발효 과정 중 당 함량을 측정한 결과(Fig. 1(B)), 알코올 발효가 진행됨에 따라 양파식초의 당도는 0일에 25.6 °Brix에서 8일에 15 °Brix로 감소하였으며, 흑양파식초는 0일에 24.8 °Brix에서 8일에 15.4 °Brix를 나타내었다. 따라서 알코올 발효 8일에 양파식초와 흑양파식초의 당도는 비슷한 수치를 나타냄을 알 수 있었다. 이전 연구에 의하면 양파식초를 알코올 발효 시 이를 통해 양파식초와 흑양파식초 제조 과정에서 알코올 발효 시간이 지남에 따라 효모가 당을 이용하여 알코올을 생성한 것으로 사료된다. 이전 연구에서 양파식초의 알코올 발효 24시간에 당 함량이 급격히 감소하였고 알코올 함량은 이와 반비례하여 증가하였는데, 본 연구와 비슷한 경향을 나타내었다(Shin 등, 2002). 또한, 이전 연구에서 양파식초는 발효 60시간 종료 후 6.6%, 7.8% 등의 수치를 나타내었으나 본 연구에서의 양파식초 및 흑양파식초는 이보다 높은 알코올 함량 수치를 나타내었다(Shin 등, 2002).

Fig. 1. Changes in alcohol (A) and sugar (B) contents of onion vinegar (OV) and black onion vinegar (BV) during alcohol fermentation for 8 days.

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양파식초 및 흑양파식초 제조 과정에서 알코올 발효가 끝난 뒤 20일간 초산 발효를 진행하였으며, 초산 발효 과정 중 pH와 총 산도 측정 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 발효 전 양파식초 및 흑양파식초의 pH는 각각 3.65 및 3.45의 수치를 나타내었으며, 이후 완만하게 pH 수치가 감소하여 발효 20일째 양파식초 및 흑양파식초의 pH는 각각 2.96 및 2.76의 수치를 나타내었다(Fig. 2(A)). 초산 발효 과정 중 총 산도를 측정한 결과(Fig. 2(B)), 발효 전 양파식초 및 흑양파식초는 각각 1.99% 및 1.63%의 수치를 나타내었다. 반면 발효가 진행됨에 따라 점차 산도가 증가하였으며, 양파식초는 발효 20일째 양파식초 및 흑양파식초는 각각 5.2% 및 5.3%의 유사한 수치를 나타내었다. 따라서 양파식초 및 흑양파식초의 초산 발효과정에서 총 산도가 증가함에 따라 pH가 감소하는 것을 알 수 있었다. 이는 이전 연구에서 흑마늘 식초 제조 시 초산 발효 시간이 경과함에 따라 pH가 감소하고 총 산도가 증가하였다는 연구와 유사한 경향을 나타내었다(Seo 등, 2016). 본 연구에서 양파식초는 초기산도 1.99%에서 발효 20일째 5.2% 수치로 증가하였는데 이는 양파식초 제조 시 초기산도 1.59%에서 발효 10일에 5.39%를 나타낸 이전 연구와 유사한 수치를 나타내었다(Shin 등, 2002). 산도는 초기 알코올 농도 및 초기 산도의 영향을 받는데, 이는 알코올 발효를 시킨 뒤 알코올 농도를 6%로 동일하게 조정한 결과로 인한 것으로 생각된다.

Fig. 2. Changes in pH (A) and total acidity (B) of onion vinegar (OV) and black onion vinegar (BV) during acetic acid fermentation for 20 days.

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양파식초 및 흑양파식초를 발효 과정을 거치지 않은 양파즙 및 흑양파즙과 비교하여 유리당 함량을 비교 분석하였다(Table 1). 먼저 양파즙과 흑양파즙의 총 유리당 함량 측정 결과 각각 239.6 g/L 및 211.2 g/L의 수치를 나타내어 양파즙의 총 유리당 함량이 더 높았다. 양파즙 및 흑양파즙의 유리당 주요 성분을 측정한 결과, 주로 fructose 및 glucose 성분인 것을 알 수 있었다. 특히 fructose 함량은 양파즙에 비해 흑양파즙이 더 높았으며, glucose 함량은 흑양파즙에 비해 양파즙이 더 높은 수치를 나타내었다. 이전 연구에서 국내산 양파에 함유되어 있는 유리당이 주로 fructose, glucose, sucrose로 보고한 것과 유사한 결과를 나타내었다(Suh 등, 1996). 양파와 흑양파를 이용하여 발효식초를 제조한 뒤 유리당 함량 측정 결과, 양파식초 및 흑양파식초의 총 유리당 함량이 각각 50.9 g/L 및 80.1 g/L의 수치를 나타내어, 양파즙 및 흑양파즙에 비해 각각 낮은 수치를 나타내어 발효 과정을 통해 유리당 함량이 감소한 것을 알 수 있었다. 이는 양파를 이용하여 식초 형태로 발효했을 때 유리당 함량이 감소했다는 이전 연구와 유사한 경향을 나타냄을 알 수 있었다(Shim 등, 2002). 양파식초 및 흑양파식초의 유리당 주요 성분을 측정한 결과, 주로 fructose 및 glucose 성분인 것을 알 수 있었다. 특히 흑양파식초의 주요 성분은 fructose(42.6 g/L) 및 glucose (37.5 g/L)으로 확인되었으며, 이는 양파식초의 fructose (19.7 g/L) 및 glucose(21.4 g/L) 함량에 비해 높은 수치임을 알 수 있었다. 또한, 흑양파즙의 경우 sucrose 및 lactose 성분이 일부 검출되었으나, 발효 시 이들 성분이 검출되지 않는 특징을 나타내었다. 이는 이전 연구에서 발효 시간이 지남에 따라 양파 식초의 sucrose 성분이 가장 먼저 소비되는 결과와 유사한 경향을 나타내었다(Shim 등, 2002).

양파즙, 흑양파즙, 양파식초 및 흑양파식초의 유기산 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 양파즙, 흑양파즙, 양파식초 및 흑양파식초의 총 유기산 함량을 측정한 결과, 각각 11.04 g/L, 7.53 g/L, 71.70 g/L 및 56.10 g/L의 수치를 나타내었다. 양파 및 흑양파 모두 발효 과정을 거쳐 식초로 제조했을 때 유기산 함량이 높아진 것을 확인할 수 있었다. 이는 이전 연구에서 양파즙에 비해 양파 발효액에서 유기산이 높아진 연구와 유사한 경향을 나타내었다(Jeong과 Cha, 2016). 또한, 본 연구에서 흑양파식초는 양파식초에 비해 유기산 함량이 낮았는데, 이는 흑양파즙이 양파즙에 비해 유기산 함량이 낮은 수치를 나타냄과 유사한 결과를 나타내었다. 본 연구에서 양파식초 및 흑양파식초의 주요 유기산은 acetic acid 및 malic acid임을 알 수 있었다. 이전 연구에서도 양파식초의 주요 유기산은 acetic acid, malic acid, succinic acid, citric acid로 보고된 바 있으므로, 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다(Jeong와 Cha, 2016). 본 연구 결과에서 양파식초에는 acetic acid가 37.6 g/L, malic acid가 33.6 g/L 함유된 반면 흑양파식초는 acetic acid를 45.9 g/L, malic acid를 9.73 g/L 함유하고 있었다. 따라서 흑양파식초는 양파식초에 비해 acetic acid 함량이 높았으며, 반면 malic acid 함량은 낮은 것을 알 수 있었다.

폴리페놀 성분은 천연물 유래 소재에 함유되어 있는 대표적인 항산화 물질로 알려져 있으며, 화합물 내 포함된 hydroxyl 기가 radical 소거능을 갖는 것으로 보고되었다(Myburgh, 2014). 플라보노이드 성분은 폴리페놀에 속해있는 물질로써, 다양한 천연물 유래 소재에 포함되어 있다(Kozłowska와 Szostak-Wegierek, 2014). 양파에는 quercetin, kaempferol, rutin 등의 폴리페놀 및 플라보노이드 성분이 함유된 것으로 보고된 바 있다(Galavi 등, 2021). 양파즙, 흑양파즙, 양파식초 및 흑양파식초의 총폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과를 Table 3에 나타내었다. 양파즙, 흑양파즙, 양파식초 및 흑양파식초의 총폴리페놀 함량을 측정한 결과, 각각 98.79, 99.09, 91.37 및 90.31 mg GAE/g의 수치를 나타내어 양파 및 흑양파즙에 비해 발효과정을 거친 양파 및 흑양파 식초의 폴리페놀 성분이 다소 감소한 것을 알 수 있었다. 반면 양파즙, 흑양파즙, 양파식초 및 흑양파식초의 총플라보노이드 함량을 측정한 결과, 양파즙 및 양파식초에 비해 각각 흑양파즙 및 흑양파식초가 일부 높은 플라보노이드 함량을 나타내었으나 모든 시료 간 통계 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이전 연구에서 폴리페놀 성분의 아세트산화 반응을 유도했을 때 폴리페놀 성분이 40%까지 감소하는 것으로 보고됨에 따라 식초 제조 시 발효 과정인 아세트산화 반응에 의해 폴리페놀 성분이 일부 감소한 것으로 사료된다(Andlauer 등, 2000). 양파식초 발효기간 동안 총플라보노이드 함량이 다소 감소하였는데, 이는 양파의 주요 플라보노이드 성분인 rutin과 quercetin diglucoside가 식초 발효기간이 증가할수록 감소된 것으로 사료된다(Cheun 등, 2005). 이 외에도, 양파식초 제조 시 열처리는 quercetin diglucoside, quercetin monoglucoside 등 플라보노이드 성분이 용매로 유출되는 것으로 보고됨에 따라, 열처리 유무 및 열처리 시기가 양파식초의 플라보노이드 함량 변화에 영향을 미쳤을 것으로 사료된다(Cheun 등, 2005).

DPPH radical은 nitrogen을 포함하는 안정한 형태의 free radical이며, 항산화 물질은 DPPH radical과 반응하여 전자 또는 수소를 전달한다(Hatano 등, 1989). 이 과정에서 보라색의 DPPH 시약은 노란색으로 변화되어 시료의 항산화 활성 정도를 측정할 수 있으며, 간단하고 짧은 시간 내 측정이 가능하여 in vitro에서 천연물 유래 소재의 항산화 활성을 평가하는 데 널리 사용되고 있다(Hatano 등, 1989; Gulcin, 2020). 양파즙, 흑양파즙, 양파식초 및 흑양파식초의 농도별 DPPH radical 소거능을 Fig. 3에 나타내었다. 4가지 시료 모두 농도 유의적으로 DPPH radical 소거능이 증가함을 알 수 있었다. 특히 흑양파즙은 양파즙에 비해 모든 농도에서 유의적으로 DPPH radical 소거능이 증가하였다. 또한 양파식초 및 흑양파식초는 각각 양파즙 및 흑양파즙에 비해 DPPH radical 소거능이 증가하여 식초 형태로 제조 시 즙에 비해 항산화 활성이 향상되는 것을 알 수 있었다. 흑양파식초는 100, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도에서 각각 19.27%, 44.17%, 66.21%, 79.42%의 수치를 나타내었는데, 이들 중 100, 250, 500 μg/mL의 농도에서는 다른 시료에 비해 유의적으로 가장 높은 DPPH radical 소거 활성을 나타내었다. 이전 연구에 의하면, 흑양파 물 추출물은 양파 물 추출물에 비해 DPPH radical 소거능이 높은 것으로 보고되어 본 연구결과와 유사한 결과를 나타내었다(Yang와 Park, 2011b).

Fig. 3. DPPH radical scavenging activity of onion juice (OJ), black onion juice (BJ), onion vinegar (OV), and black onion vinegar (BV). Values are means±SD (n=6). ^a-dMeans with the different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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양파즙, 흑양파즙, 양파식초 및 흑양파식초의 농도별 ABTS⁺ radical 소거능을 Fig. 4에 나타내었다. 4가지 시료 모두 농도의존적으로 ABTS⁺ radical 소거능이 증가하였다. 특히 양파즙에 비해 흑양파즙의 ABTS⁺ radical 소거능이 높았으며, 양파즙 및 흑양파즙에 비해 발효과정을 거친 양파식초 및 흑양파식초의 ABTS⁺ radical 소거능이 높게 나타났다. 또한, 흑양파식초는 100, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도에서 각각 8.09%, 20.71%, 40.34%, 69.04%의 수치를 나타내었는데, 다른 시료에 비해 동일한 농도에서 ABTS⁺ radical 소거능이 유의적으로 가장 높은 것을 알 수 있었다. 이전 연구에서도 100-1,000 μg/mL의 농도의 흑양파 추출물은 동일한 농도의 양파 추출물에 비해 ABTS⁺ radical 소거능이 높아 항산화 활성이 우수한 것으로 보고되어 본 연구와 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Yang와 Park, 2011b). 따라서 본 연구 결과를 통해 흑양파식초는 양파즙, 흑양파즙 및 양파식초에 비해 in vitro에서 radical 소거를 통한 항산화 활성이 우수한 것으로 사료된다. 본 연구에서 양파 및 흑양파를 식초로 제조했을 때 대표적인 항산화 물질로 알려져 있는 총폴리페놀 및 플라보노이드 성분은 일부 감소하였으나 DPPH 및 ABTS⁺ radical 소거능은 증가한 결과를 나타내었다. 이전 연구에서 양파 추출물에 비해 양파식초에서 taurine, proline, alanine, citulline, valine, cystine, phenylalanine, β-alanine, β-aminoisobutyric acid, γ-amino-n-butyric acid, histidine, anserine, ornitine 등의 성분이 증가하였으며, 이들은 국내외 연구에서 항산화 활성이 보고된 바 있다(Jung과 Cha, 2016). 따라서 이들 성분 변화로 인해 항산화 활성이 증가된 것으로 사료되어지나 양파 및 흑양파와 이를 이용하여 제조한 양파식초 및 흑양파식초의 생리활성물질 변화와 관련한 연구가 필요한 것으로 사료된다.

Fig. 4. ABTS⁺ radical scavenging activity of onion juice (OJ), black onion juice (BJ), onion vinegar (OV), and black onion vinegar (BV). Values are means±SD (n=6). ^a-cMeans with the different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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