다소비 식품에 대한 비타민 D 함량 분석 다소비 식품에 대한 비타민 D 함량 분석

본 연구에서 비타민 D 추출을 위해 사용된 pyrogallol 시약은 TCI사(Tokyo, Japan)로부터 구입하였고, 에탄올, 메탄올 및 n-헥산은 Honeywell(Morris plains, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 표준품인 비타민 D₂와 비타민 D₃는 TCI사의 순도 98% 이상의 HPLC급을 구입하여 사용하였으며, 그 외 실험에 사용된 시약은 특급 이상을 사용하였다.

본 연구에서 사용된 시료는 국민건강영양조사를 통해 생산되는 국민건강통계를 참고로 하여 국내 다소비, 다빈도 이용식품과 통계청의 농림어업 총 조사 등을 활용하여 선정한 다소비 작목 중 주요 작목의 품종별로 샘플링되었고, 샘플링된 작목은 다시 단순 가공 단계별로 나누어 선정하였다. 이렇게 선정된 시료들은 2019년 농촌진흥청이 국가표준 식품성분표 제10개정판을 발간하기 위한 연구사업의 일환으로 선정되었다.

최종 선정된 시료로는 곡류(45종), 두류(12종), 견과 및 종실류(1종), 채소류(9종), 과일류(10종), 홍삼(3종), 해조류(1종), 버섯류(36종), 육류(9종), 난류(1종), 유제품(3종), 어패류 및 기타수산물(20종), 차류 및 음료류(8종), 당류(1종), 유지류(7종), 조미료류(16종)의 총 181종이었다. 이들 시료는 국립농업과학원 기능성식품과에서 수세 및 수분제거를 한 다음, 가로세로 약 1 cm 정도 크기로 절단하고 액체질소로 급속냉동하여 균질화 과정을 거쳐 동결 후 배송되었으며, 배송된 시료는 −70°C 냉동고에서 보관하면서 분석에 사용하였다.

비타민 D 함량 분석은 균질화된 시료를 수산화칼륨과 피로가롤․에탄올 용액을 이용하여 검화시킨 후 동시 추출하였다(MFDS, 2014). 갈색 검화 플라스크에 균질화된 시료 1-3 g을 정밀히 취한 후, 10% 피로가롤․에탄올 용액 40 mL를 가하여 약하게 진탕 혼합하였다. 여기에 90% 수산화칼륨용액 10 mL를 가하고 진탕 혼합하였다. 검화 플라스크를 환류냉각관을 부착하여 비등수욕 중에서 60분간 가열하여 검화하였다. 검화 완료한 시료는 즉시 실온으로 냉각하고 갈색 분액깔때기로 옮긴 후 헥산 50 mL를 가하여 10분간 강하게 진탕 혼합하였다. 일정시간 방치하여 층 분리가 되면 상등액은 수집하고 남은 하층에 헥산 50 mL를 가하여 2회 더 반복 추출하여 상등액을 수집하였다. 수집된 전체 상등액에 1 N 수산화칼륨용액 100 mL를 가하여 진탕혼합한 후 방치하여 층 분리를 진행 후 혼탁한 물층을 제거하였다. 헥산층에 0.5 N 수산화칼륨용액 40 mL를 가하여 진탕한 후 방치하여 층 분리가 되면 물층은 다시 버리고 헥산층은 세척액이 페놀프타레인 시약에 알칼리반응이 나타나지 않을 때까지 충분히 세척하였다. 수세가 끝난 헥산층은 무수황산나트륨으로 탈수하여 갈색 감압농축플라스크에 옮겨 40°C 이하에서 감압농축하였다. 농축하여 얻어진 잔류물에 메탄올 4 mL를 가하여 재용해시켜 0.45 μm membrane filter로 여과한 후, 비타민 D 분석용 시험용액으로 사용하였다.

비타민 D 분석은 시험용액을 LC-MS/MS(high performance liquid chromatography mass spectrometry, Triple Quad 4500 AB Sciex Instruments, Framingham, Massachusetts, USA)로 분석하여 비타민 D₂ 및 D₃ 함량을 정량하였다. 분석조건으로는 C₁₈ column(CAPCELL CORE C₁₈, SHISEIDO, Tokyo, Japan)을 이용하여 이동상(5 mM ammonium acetate: methanol = 5:95)을 60°C에서 0.45 mL/min으로 흘려주었으며, 질량분석기는 ESI positive 조건에서 capillary 온도 750°C, collision 가스는 N₂를 사용하였다. 이때 모든 시료는 2회 반복 분석하였으며, 비타민 D₂ 및 D₃ 함량의 평균값으로 나타내었다(Table 1).

비타민 D 분석방법에 대한 정확성 평가를 위하여 정기적으로 표준인증물질로 CRM(Certified reference material)인 BCR-122[Margarine, IRMM(Institute for Reference Materials and Measurements), EU] 및 SRM3235 [Soymilk, NIST(National Institute of Standards and Technology), USA]를 이용하여 분석방법의 정확성 및 회수율을 검증하였다. CRM은 분석방법, 측정방법의 정확성을 평가할 수 있게 정확한 특성 값이 정해진 균일하고 안정적인 표준물질로 많은 연구기관에서 이용하고 있다.

본 실험에서 얻어진 LC-MS/MS chromatogram으로부터 각 분석물질 주변 peak의 신호/잡음(signal/noise, S/N)의 비율이 3에 해당하는 각각의 농도를 검출한계(limit of detection, LOD)로 하였으며, S/N 비 10에 해당하는 각각의 농도를 정량한계(limit of quantitation, LOQ)로 계산하였다.

분석방법의 정밀성(precision)을 평가하기 위하여 품질관리시료로 건조표고버섯과 브로콜리 혼합물 및 조제분유를 매회 분석하여 분석결과에 대한 품질을 관리하였다. 95% 수준의 경고한계(2SD: standard deviation)를 넘을 경우 재분석으로 판정하였으며, 99% 수준의 조절한계(3SD)를 넘을 경우 실험방법, 실험환경 등을 시정하여 허용범위에 들도록 관리하였다.

각 비타민 D의 분석 정량 값은 IBM SPSS Statistics 25 (Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 시료 간의 차이 유무를 분산분석(ANOVA)을 시행한 후, Duncan’s multiple range test (p<0.05)를 실시하여 각 시료 간의 유의성을 검증하였다.

다소비 곡류 45종으로 분류된 옥수수(건조) 11품종, 수수(생) 3품종, 기장(생) 3품종, 조(생) 8품종, 백미(생) 10품종, 현미 10품종을 대상으로 비타민 D₂ 및 D₃ 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같이, 옥수수, 백미, 흑미 등을 포함한 45종의 곡류에서 비타민 D₂와 D₃는 모두 검출되지 않았다.

또한, 두류 12종, 견과 및 종실류 1종, 채소류 9종, 과일류 10종, 홍삼류 3종 및 해조류 1종을 대상으로 비타민 D₂ 및 D₃ 함량을 분석한 결과에서도 이들 36종의 식품에서 비타민 D가 검출되지 않았다(Table 3). 즉 두류 12종, 견과 및 종실류 1종, 채소류 9종 및 홍삼류 3종의 대상 식품들을 생으로 또는 가열하거나, 찌고, 건조하여도 비타민 D 함량 차이 없이 비타민 D₂ 및 D₃가 검출되지 않았으며, 귤(생) 8품종, 오렌지, 자두 및 해조류에서도 비타민 D가 검출되지 않았다. 따라서 국내에서 다소비 되고 있는 이들 곡류, 두류, 견과 및 종실류, 채소류, 과일류, 홍삼, 해조류에서는 비타민 D가 존재하지 않았다.

버섯류를 대상으로 비타민 D₂와 D₃ 함량을 분석한 결과는 Table 4와 같이, 36종의 모든 버섯류에서 비타민 D₃는 검출되지 않았으나, 꽃송이버섯, 표고버섯, 양송이버섯, 큰느타리버섯, 목이버섯 및 갈색팽이버섯에서는 비타민 D₂가 검출되었다. 그 중 꽃송이버섯은 자연건조에서 147.96± 8.24 μg/100 g의 가장 높은 비타민 D₂ 함량을 보였으며, 기기건조에서도 2.13±0.46 μg/100 g의 비타민 D₂ 함량을 나타내었다. 그리고 자연건조한 표고버섯에서 77.59± 12.82 μg/100 g, 양송이버섯에서 68.81±1.18 μg/100 g, 큰느타리버섯에서 62.33±14.51 μg/100 g, 목이버섯에서 9.26±0.54 μg/100 g의 높은 비타민 D₂ 함량을 나타내었으나, 표고버섯, 양송이버섯 및 큰느타리버섯의 생것, 데친 것 및 기기건조한 것에서는 비타민 D₂가 검출되지 않았다. 그러나 목이버섯은 생것에서 0.75±0.92 μg/100 g, 데친 것에서 0.87±0.09 μg/100 g, 기기건조에서 8.08±0.70 μg/100 g, 자연건조에서 9.26±0.54 μg/100 g 순으로 비타민 D₂ 함량을 나타내었다. 즉 목이버섯은 다른 버섯과는 다르게 가공 공정에 따른 차이 없이 비타민 D₂가 존재하였다. 특히 꽃송이버섯, 표고버섯, 양송이버섯, 큰느타리버섯 및 목이버섯은 자연건조시에 비타민 D₂ 함량이 크게 증가함을 알 수 있었다.

한편, 갈색팽이버섯 생것에서 2.61±0.33 μg/100 g, 데친것에서 1.43±0.24 μg/100 g의 비타민 D₂가 검출되었으며, 그 외 흰백목이버섯 등 6종 버섯류의 생것과 데친 것에서는 비타민 D가 검출되지 않았다. 상황버섯 및 영지버섯 침출액의 건조물에서도 비타민 D가 검출되지 않았다.

일반적으로 버섯은 햇빛이나 자외선 조사에 의하면 높은 비타민 D 함량을 생성할 수 있다는 보고(Cardwell 등, 2018)처럼, 본 연구에서도 꽃송이버섯, 표고버섯, 양송이버섯, 큰느타리버섯 및 목이버섯은 자연건조시에 비타민 D₂ 함량이 크게 증가함을 확인하였다.

Pyo 등(2020)의 연구에 따르면 5종의 버섯(새송이, 느타리, 팽이, 양송이, 표고)을 미세분말화하여 UV-B 조사에 따른 비타민 D₂ 전구체인 ergosterol과 비타민 D₂의 함량을 분석하여 UV-B 조사에 따른 전환율을 확인하였다. 자외선 조사 전 표고버섯 분말에서 2.55 mg/g, 양송이버섯 2.42 mg/g, 느타리버섯 1.92 mg/g 순으로 ergosterol의 함량을 확인할 수 있었으며 비타민 D₃는 확인되지 않았다. 30분 동안 자외선 조사를 한 후 버섯 분말의 비타민 D₂ 함량을 비교한 결과 표고버섯(76.12 μg/g), 양송이버섯(55.41 μg/g), 느타리버섯(40.13 μg/g) 순으로 비타민 D₂ 전구체 함량이 높은 순으로 비타민 D₂가 전환된 것을 확인하였다. 즉 표고버섯, 양송이버섯, 느타리버섯을 자연건조 하여 분석한 본 연구보다, 자외선 조사로 제조한 이들 버섯에서 비타민 D₂ 함량이 더 높게 존재하였는데, 이는 직접적인 자외선 조사에 의해 비타민 D₂로의 전환율이 크게 증가하여 비타민 D₂ 함량이 증가된 것으로 생각된다. 또한, 자연건조에 의해서도 비타민 D₂의 함량이 높아지는 것은 건조 후 수분함량의 감소와 자연건조 중의 자외선 조사도 진행되어 비타민 D₂가 생성이 되는 것으로 사료된다.

Kim 등(2012)의 연구에 따르면 목이버섯 품종과 영양성분 비교 시에 털목이, 흑목이, 갈색목이버섯 3품종의 비타민 D₂ 함량 비교시 흑목이버섯 5.45 μg/g, 갈색목이버섯 2.76 μg/g, 털목이버섯 1.66 μg/g 순으로 목이버섯 품종 간의 함량차이가 있었다. 이처럼 버섯류의 품종에 따른 비타민 D 함량의 차이가 존재하는 것처럼, 본 연구에서도 버섯 종류별에 따른 비타민 D 함량 차이를 보이는 것으로 사료된다.

육류(햄, 순대) 9종, 난류(피단) 1종, 유제품(생크림, 동물성 및 식물성 휘핑크림) 3종, 기타수산물(젓갈, 액젓, 통조림 등)을 포함한 20종의 식품에 대한 비타민 D₂와 D₃ 함량을 분석한 결과는 Table 5와 같다. 그 결과 육류(햄, 순대)와 유제품(생크림, 동물성 및 식물성 휘핑크림)에서는 비타민 D가 검출되지 않았으며, 난류(피단)에서 비타민 D₃가 7.07±0.87 μg/100 g 검출되었다. 기타 수산물 중에서는 명란젓에서 비타민 D₃가 1.84±0.13 μg/100 g 검출되었으며, 연어통조림(전체)에서 8.67±0.32 μg/100 g, 연어통조림(고형물)에서 8.90±1.45 μg/100 g, 훈제연어 생것에서 5.62±0.51 μg/100 g의 비타민 D₃가 검출되었다. 피단은 중국요리에서 오리알이나 달걀을 삭힌 음식으로, Lim 등(2019)의 연구에서 난류(메추리알, 달걀, 오리알)의 가공 전, 후 비타민 D 함량을 분석한 결과 난백에서는 비타민 D가 모두 검출되지 않았으나, 난황에서는 메추리알(3.59-4.99 μg/100 g), 오리알(20.85-22.30 μg/100 g), 달걀(63.96-95.04 μg/100 g)에서 비타민 D₃가 검출되어 피단의 비타민 D₃의 검출은 난류의 난황에서 검출된 것으로 생각된다.

생선류에는 비타민 D₃의 함량이 높으며, 살코기보다는 지방이 많은 생선인 고등어, 연어, 무지개 송어 등이 지방함량이 적은 생성보다 비타민 D의 함량이 높다는 보고(Malesa-Ciecwierz와 Usydus, 2015)처럼 연어통조림 및 훈제연어에서 비타민 D₃의 함량이 높게 함유되었음을 알 수 있었다. 또한, Lu 등(2007)의 연구에서 자연산 연어와 양식 연어의 비타민 D₃의 함량을 비교한 결과 자연산 연어는 988±524 IU vitamin D₃/3.5 oz(249.0 μg/kg), 양식 연어는 240±108 IU vitamin D₃/3.5 oz(60.5 μg/kg)였고, 양식연어의 조리법에 따른 비타민 D 함량 비교 시 구운 양식연어는 240 IU vitamin D₃/3.5 oz였으며, 식물성 기름으로 튀긴 양식연어는 123 IU vitamin D₃/3.5 oz로 조리법에 따라 비타민 D₃의 함량이 달라지는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서도 연어의 가공방법에 따라 비타민 D의 함량에 차이나는 것으로 생각된다.

차류 및 음료류(코코아차 외) 8종, 당류(로얄젤리) 1종, 유지류(쇼트닝 외) 7종, 조미료류(마요네즈 외) 16종을 대상으로 비타민 D₂와 D₃ 함량을 분석한 결과는 Table 6과 같으며, 이들 32종의 식품군에서는 비타민 D가 검출되지 않았다.

비타민 D 분석방법에 대한 정확성을 평가하기 위하여 정기적으로 CRM에 대한 분석을 실시하였으며, 그 결과는 Table 7과 Fig. 1에 나타내었다. 먼저 참값이 알려져 있는 BCR-122(Margarine)와 SRM 3235(Soy milk)를 이용하여 분석기간 중 반복 분석하였다. 그 결과, 분석기간 내내 참값 허용범위를 벗어나지 않았으며, 이들 회수율은 각각 98.40% 및 104.17%로 허용범위를 만족하였다. 또한, 분석 품질관리를 위해 분유(비타민 D₃)와 브로콜리, 표고버섯 가루(비타민 D₂)를 12회 이상 반복하여 비타민 D를 분석한 결과, 모든 데이터가 경고한계 범위 내에 존재하여 지속해서 양호한 분석 품질을 유지할 수 있었다(Fig. 2). 본 실험의 유효성 검증을 위한 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ)를 측정한 결과 비타민 D₂의 LOD는 100 g 당 0.21 μg, LOQ는 100 g 당 0.69 μg이었으며, 비타민 D₃의 LOD는 100 g 당 0.13 μg, LOQ는 100 g 당 0.44 μg이었으며, 비타민 D의 표준 검량선의 결정계수(R²)는 0.99 이상으로 우수한 직선성을 나타내었다.

Fig. 1. Chromatogram of vitamin D standard solution (A) and SRM3235 (B) by LC-MS/MS.

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Fig. 2. Quality control (QC) chart for accuracy of vitamin D analysis. Same vitamin D₂ and D₃ quality control chart as shown in (A), (B). When QC values deviate outside the 3SD confidence interval or showed a trend, the analytical run was rejected and corrective action was taken.

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